張煒煜，楊修軍，王 慧，張立夫，李可維

(吉林省疾病預(yù)防控制中心， 吉林 長(zhǎng)春130062)

吉林省耐多藥結(jié)核分枝桿菌rpoB及katG基因突變特征分析

張煒煜，楊修軍*，王 慧，張立夫，李可維

(吉林省疾病預(yù)防控制中心， 吉林 長(zhǎng)春130062)

目的分析吉林省耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rpoB、katG基因突變特點(diǎn)，為建立本省快速耐多藥檢測(cè)方法提供參考。方法對(duì)吉林省耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株擴(kuò)增rpoB、katG基因測(cè)序后比對(duì)分析。結(jié)果耐多藥結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG基因的突變率分別為 83.53 %和70.6%，突變類型包括點(diǎn)突變、聯(lián)合突變和缺失。在rpoB基因中，82.30 %突變發(fā)生在RRDR區(qū)域，最常見突變位點(diǎn)為rpoB 531、rpoB 526、rpoB 516。KatG基因突變率為70.6 %，最常見突變位點(diǎn)為katG315，占所有突變的68.55%。結(jié)論吉林省耐多藥結(jié)核分枝桿菌最常見突變位點(diǎn)為 rpoB 531、 rpoB 526、rpoB 516和katG 315。

結(jié)核分枝桿菌；耐多藥;rpoB;katG；基因突變

(ChinJLabDiagn,2017,21:1731)

耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的發(fā)生與傳播是當(dāng)前結(jié)核病疫情嚴(yán)重的主要原因之一[1]。截止到2015年，在估計(jì)的58萬符合耐多藥結(jié)核病治療條件的新發(fā)病例中，只有12.5萬(20%)登記接受治療[2]。耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn)，對(duì)全球消滅結(jié)核病的目標(biāo)和各國(guó)公共衛(wèi)生提出了新的挑戰(zhàn)[2]。抗結(jié)核藥物耐藥性監(jiān)測(cè)已經(jīng)成為控制耐多藥結(jié)核病流行的有效手段。已有研究表明,耐多藥結(jié)核病的產(chǎn)生與耐藥基因(rpoB和katG)突變密切相關(guān)[3-6]。不同地理區(qū)域的結(jié)核分枝桿菌的遺傳進(jìn)化過程受到環(huán)境影響,其耐藥基因突變類型和頻率存在較大差異[6-8],研究吉林省MDR-TB耐藥相關(guān)基因突變特征,為建立快速、準(zhǔn)確和特異的耐多藥結(jié)核病診斷技術(shù)提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株

500株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株來源于2013-2015年吉林省4個(gè)地區(qū)臨床分離株(長(zhǎng)春地區(qū)298株、延邊地區(qū)86、吉林地區(qū)65株、通化地區(qū)51株)，80株藥物敏感菌株來源于吉林省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室菌株庫(kù)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照菌株為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)。

1.2方法

1.2.1分離菌株藥物敏感性試驗(yàn) 采用比例法進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)[9]，包括異煙肼(INH)、利福平(REF)、卡那霉素(Km)、氧氟沙星(Ofx)。含藥培養(yǎng)基內(nèi)藥物終濃度分別為異煙肼0.2 μg /mL、利福平 40 .0 μg/mL、氧氟沙星 2.0 μg/mL 和卡那霉素30 μg/mL，統(tǒng)一購(gòu)自珠海貝索公司，且在有效期內(nèi)使用。

1.2.2結(jié)核分枝桿菌DNA模板的制備 取改良羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)、生長(zhǎng)良好的的克隆菌1標(biāo)準(zhǔn)環(huán)，加入到200 μl TE的EP管中，85℃金屬浴30 min滅活，然后100℃金屬浴10 min，冰浴5 min，13 000 rmp/min 離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新管中即為DNA模板，-20℃保存待用。

1.2.3耐藥基因擴(kuò)增及測(cè)序 從http：//www.ncbi.nlm.nih.gov的Genbank中獲得結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)rpoB、katG基因標(biāo)準(zhǔn)序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。擴(kuò)增的基因片段送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序分析。

表1 PCR 引物序列

1.2.4測(cè)序結(jié)果比對(duì) 測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定基因突變位點(diǎn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用MEGA 6.06軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1耐藥基因序列比對(duì)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)對(duì)照菌株的rpoB、katG基因測(cè)序結(jié)果與Genbank公布的結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)耐藥基因標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，表明本次耐藥基因擴(kuò)增目標(biāo)序列結(jié)果準(zhǔn)確。MDR-TB菌株耐藥基因測(cè)序結(jié)果采用MEGA6.06軟件分析，與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rpoB、katG基因序列進(jìn)行多序列分析，分析各菌株耐藥基因突變位點(diǎn)及突變類型。

2.2MDR-TB菌株rpoB基因突變特征

500株MDR-TB菌株中，486株獲得rpoB基因測(cè)序結(jié)果。測(cè)序結(jié)果與rpoB基因(基因編號(hào)888164)序列比對(duì)，突變率為83.53%(406/486)。80株藥物敏感菌株未檢測(cè)到rpoB基因突變。406株rpoB基因突變菌株共發(fā)現(xiàn)50種基因突變類型(包括：堿基突變、缺失和插入)。其中，單堿基突變、雙堿基突變、多堿基突變、堿基缺失的發(fā)生率分別為69.55%(338/486)、10.49%(51/486)、1.85%(9/486)、1.65%(8/486)。在堿基突變統(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn)，rpoB基因突變主要發(fā)生在507-533位的81個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)，占 82.30 %(400/486),突變發(fā)生在前3順位的是rpoB 531(179/486,36.83%)、rpoB 526(122/486,25.10%)、rpoB 516(48/486,9.88%)，具體情況見表2。13株MDR-TB菌株單位點(diǎn)堿基突變位于RRDR決定區(qū)外，為386、389、403、430、457、480、490；1株菌株發(fā)生雙堿基突變r(jià)poB403(ATC→GTC)聯(lián)合rpoB424(CAC→CGC)，該雙突變位點(diǎn)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)外的研究極少發(fā)現(xiàn)耐利福平結(jié)核分枝桿菌缺失和插入突變,本研究中3例MDR-TB菌株中檢測(cè)出堿基缺失，其中2株菌株缺失位點(diǎn)為516-520位點(diǎn)，1株菌株位點(diǎn)缺失為rpoB 519，2株MDR-TB菌株插入序列為rpoB 514，均位于RRDR決定區(qū)內(nèi)。另外，80株MDR-TB菌株未檢測(cè)到rpoB基因突變，可能存在結(jié)核分枝桿菌耐RFP機(jī)制的新說法。

表2 MDR-TB菌株rpoB基因突變特征檢測(cè)

aIncluding two isolates having synonymous mutations at 533 (CTG→GCC ) or 442(ACC→ACT) meanwhile.

2.3MDR-TB菌株katG基因突變特征

本研究發(fā)現(xiàn)，353株菌株檢測(cè)到katG基因突變，共發(fā)現(xiàn)堿基點(diǎn)突變、聯(lián)合突變和堿基缺失等26種基因突變類型，具體見表3。katG基因總突變率為70.6%(353/500)，katG315位點(diǎn)突變占所有位點(diǎn)突變的68.55%(242/353)。katG315突變存在5種突變類型，發(fā)生AGC→ACC突變的菌株較多，數(shù)目為204株，比例占發(fā)生katG315位點(diǎn)突變菌株的84.30 %(204/242)。此外，8株發(fā)生了同義突變，分別在327位點(diǎn) (AAG→AAA) 和 345位點(diǎn) (AAC→AAA)。

2.4rpoB和katG基因相關(guān)性

500株MDR-TB菌株檢測(cè)到rpoB 突變的406株，未檢測(cè)到突變的為94株。結(jié)果顯示，406株rpoB 突變菌株中292株發(fā)生katG突變，主要突變位點(diǎn)為rpoB531和katG 315。MDR-TB菌株中rpoB 基因突變與katG基因突變具有相關(guān)性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.05，P<0.01)。

表3 MDR-TB菌株katG基因突變特征檢測(cè)

bIncluding two isolates having synonymous mutations at 327 (AAG→AAA) or 345 (AAC→AAA) meanwhile.

3 討論

已有研究表明，利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌主要與編碼細(xì)菌RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因突變有關(guān)，超過90%突變位于507-533位密碼子的利福平耐藥決定區(qū)(RRDR),另有5%的突變發(fā)生在熱點(diǎn)區(qū)域外[6]。本研究中，rpoB基因總突變率為83.53%(406/486)，共發(fā)現(xiàn)堿基突變、缺失，插入等50種基因突變類型。其中，單位點(diǎn)堿基突變、雙位點(diǎn)堿基突變、多位點(diǎn)堿基突變、堿基缺失的發(fā)生率分別為69.55%(338/486)、10.49%(51/486)、1.85%(9/486)、1.65%(8/486)。RRDR區(qū)域內(nèi)rpoB基因突變率為71.6 %(348/486)，突變發(fā)生在前3順位的是rpoB 531(36.83 %)、rpoB 526(25.10 %)、rpoB 516(9.88 %)。有研究表明[10]，rpoB基因531位點(diǎn)上的Ser是利福平作用于結(jié)核分支桿菌的最關(guān)鍵的靶點(diǎn)，該位點(diǎn)發(fā)生突變將直接導(dǎo)致利福平耐藥的產(chǎn)生。rpoB 526位點(diǎn)在不同地理位置呈現(xiàn)高低不同的突變頻率[11],本研究526位點(diǎn)的突變率為22.02 %(107/486),存在7種點(diǎn)突變類型和5種聯(lián)合突變類型，進(jìn)一步提示吉林省MDR-TB菌株耐藥突變模式與其他區(qū)域間存在不同的差異性。13株MDR-TB菌株單位點(diǎn)堿基突變位于RRDR決定區(qū)外，為386、389、403、430、457、480、490；1株菌株發(fā)生雙堿基突變r(jià)poB403(ATC→GTC)聯(lián)合rpoB424(CAC→CGC)，該雙突變位點(diǎn)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中，有 16.46%(80/486)菌株未檢測(cè)到rpoB基因突變，表明除了rpoB基因突變外，尚存在其他利福平耐藥機(jī)制。

Zhang[12]等最早研究MTB的耐藥機(jī)制，提示由于katG基因的完全缺失造成了過氧化氫酶-過氧化物酶的活性喪失從而導(dǎo)致MTB對(duì)INH的高耐藥。本研究中異煙肼耐藥基因katG突變位點(diǎn)，氨基酸變化與Mekonnen等[13-15]的研究結(jié)果一致。katG基因突變導(dǎo)致異煙肼耐藥的原因主要是：315位點(diǎn)的Ser轉(zhuǎn)變成Thr，使得katG編碼的過氧化氫-過氧化物酶活性下降，導(dǎo)致異煙肼無法活化異煙酸，致使結(jié)核分支桿菌產(chǎn)生耐藥性。本研究顯示，吉林省MDR-TB菌株katG基因總突變率為70.6%(353/500)，katG基因突變高度集中于315位點(diǎn)，占68.55%(242/353)。katG315突變存在5種突變類型，發(fā)生AGC→ACC突變的菌株較多，數(shù)目為204株(84.30 %)。

吉林省MDR-TB菌株rpoB基因突變類型較多，其中rpoB基因突變最多的為rpoB 531、526、516位點(diǎn)，其突變位點(diǎn)具有多態(tài)性；katG基因突變高度集中于315位點(diǎn)。同時(shí)，本研究中292株同時(shí)發(fā)生rpoB和katG基因突變，主要突變位點(diǎn)為rpoB531和katG 315。通過對(duì)吉林省MDR-TB菌株耐藥基因突變特征分析，說明rpoB 基因81bp核心區(qū)突變和katG 315突變是MDR-TB菌株耐藥的主要分子機(jī)制。

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MutationsofrpoBandkatGdruggenesinmultidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolatesfromJilinprovince

ZHANGWei-yu,YANGXiu-jun,WANGHui,etal.

(JilinCenterforDiseaseControlandPrevention，Changchun130062，China)

ObjectiveTo analyze the mutations of rpoB and katG gene in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis(MDR-TB)isolates in Jilin Province,so as to provide reference for the establishment of rapid multi-drug resistance detection methods.MethodsComparison and analysis of rpoB and katG gene sequences of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in Jilin Province.ResultsThe mutation rates of rpoB and katG genes in MDR-TB were 83.53% and 70.6%.The mutation types included point mutation,combined mutation and deletion.In the rpoB gene,82.30% mutations occurred in the RRDR region,and the most common mutation sites were rpoB 531,rpoB 526,and rpoB 516.In the katG gene,68.55% strains mutation occurred in katG315.ConclusionThe most common mutation sites of MDR-TB in Jilin were rpoB 531、 rpoB 526、rpoB 516、katG 315.

Mycobacterium tuberculosis;multidrug-resistance;rpoB;katG;Gene mutation

R52

A

2016-05-29)

《中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)》雜志社聲明

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委科研基金項(xiàng)目(2015ZC037)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1731-05

張煒煜(1982-),女，碩士，主管技師，從事病原微生物分子流行病學(xué)研究。

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