王若冰,葉思楊,李董董,張揚(yáng)賀,張麗紅,孫千惠,申祥鳳,菅永平,王醫(yī)術(shù)*

(1.吉林大學(xué) 病理生物學(xué)教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè))

AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究

王若冰1,2,葉思楊1,2,李董董1,張揚(yáng)賀1,張麗紅1,孫千惠1,申祥鳳1,菅永平1,王醫(yī)術(shù)1*

(1.吉林大學(xué) 病理生物學(xué)教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè))

目的檢測 AKT、乳酸脫氫酶(LDH)及非肌細(xì)胞肌球蛋白重鏈II型A亞型(NMHCIIA)磷酸化(S1943)在乳腺組織中的表達(dá)情況，探討其在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用及相關(guān)性。方法采用免疫組化技術(shù)檢測AKT、LDH及NMHCIIAp-S1943在25例乳腺增生組織、25例乳腺纖維腺瘤組織和35例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果AKT、LDH、NMHCIIAp-S1943在乳腺增生組織、乳腺纖維腺瘤組織和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)情況均依次增高，即隨著乳腺組織惡性程度的增加表達(dá)增高；且AKT與LDH在乳腺組織中表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.005)，LDH與NMHCIIA p-S1943在乳腺組織中表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.005)。結(jié)論AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺組織癌變的發(fā)展過程中起著重要的作用，三者之間存在一定關(guān)系。

乳腺癌；AKT；LDH；NMHCIIA ；腫瘤微環(huán)境；免疫組化

(ChinJLabDiagn,2017,21:1687)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其死亡主要原因是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[1]。腫瘤之所以能夠發(fā)生及轉(zhuǎn)移，腫瘤微環(huán)境起著關(guān)鍵作用[2]。微環(huán)境的產(chǎn)生離不開腫瘤細(xì)胞的糖代謝，有報道顯示，腫瘤無氧糖酵解中產(chǎn)生乳酸堆積和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的發(fā)生率之間存在著正相關(guān)關(guān)系。絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT，可通過對基因表達(dá)和酶活性的調(diào)節(jié)，促進(jìn)糖酵解和乳酸的生成。非肌細(xì)胞肌球蛋白II(NMII)是細(xì)胞骨架的重要組成成分。NMII是由重鏈(NMHC)和輕鏈(NMLC)組成的，其中NMLC對NMHC起著穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用，NMHC通過磷酸化活化調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動。而乳酸對腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控是否與NMHCII有關(guān)，尚未見報道。本研究通過免疫組織化學(xué)方法觀察分析不同乳腺組織中AKT、乳酸的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶(LDH)的表達(dá)情況，并分析它們與NMHCIIA可能的關(guān)系，研究三者在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來源

篩選收集吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系2010年1月至2016年7月乳腺活檢的85例病例作為研究對象，其中乳腺增生25例，乳腺纖維腺瘤25例，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌35例。

1.2主要試劑

免疫組化SP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)，復(fù)合消化酶(天津灝陽公司)，DAB 顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)，兔抗人AKT2多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗人LDH單克隆抗體(Abcam 公司)，兔抗人NMHCIIAp-S1943單克隆抗體(Cell Signaling technology,USA)。

1.3實驗方法

按免疫組化試劑盒說明書操作。采用 OLYMPUS DPT2 CCD 圖像采集照相，然后應(yīng)用 Image-Pro Plus 6.0 軟件對圖像進(jìn)行定量分析并計算平均IOD值。

1.4統(tǒng)計方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1AKT、LDH及NMHCIIAp-S1943在乳腺組織中的表達(dá)情況

通過免疫組織化學(xué)染色觀察乳腺增生組織、乳腺纖維腺瘤及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中AKT、LDH和NMHCIIAp-S1943的表達(dá)情況，判定標(biāo)準(zhǔn)：AKT陽性表達(dá)為組織細(xì)胞胞漿/胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，LDH陽性表達(dá)為組織細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。結(jié)果顯示，AKT在乳腺組織中均呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于增生細(xì)胞、瘤細(xì)胞，癌細(xì)胞的胞漿/胞膜中，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中為強(qiáng)陽性表達(dá)，而在乳腺增生組織和乳腺纖維腺瘤中呈強(qiáng)弱不等的表達(dá)。LDH在乳腺組織中均呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于增生細(xì)胞、瘤細(xì)胞，癌細(xì)胞的胞漿中，但在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中為強(qiáng)陽性表達(dá)，而在乳腺增生組織和乳腺纖維腺瘤中呈強(qiáng)弱不等的表達(dá)。NMHCIIAp-S1943主要定位于胞膜、胞漿和(或)胞核中。在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在乳腺纖維腺瘤和乳腺增生組織中呈強(qiáng)弱不等的表達(dá)。

2.2AKT、LDH與NMHCIIAp-S1943的關(guān)系

在對乳腺增生，乳腺纖維腺瘤，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌三類標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色后，通過Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析并計算平均IOD值，結(jié)果見表1。乳腺組織標(biāo)本AKT、LDH的免疫組化染色結(jié)果平均IOD值，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得出兩者的相關(guān)系數(shù)r=0.958,P<0.005，具有統(tǒng)計學(xué)意義。LDH、NMHCIIA的免疫組化染色結(jié)果平均IOD值，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得出兩者相關(guān)系數(shù)r=0.927，P<0.005，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組別平均IOD值

3 討論

AKT又名蛋白激酶B，同其他AGC激酶一樣，受到上游的第二信使調(diào)節(jié)。同時，它還是重要的信號蛋白分子，是PI3K信號傳導(dǎo)通路重要的中心環(huán)節(jié)。AKT是細(xì)胞內(nèi)、外信號傳導(dǎo)的重要節(jié)點。癌癥中磷酸化的AKT多呈持續(xù)地高度活化狀態(tài)，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中均是如此[3,4]。高度活化的AKT可能會通過以下幾種方式參與腫瘤的發(fā)展過程：抑制細(xì)胞的凋亡與自噬，提高基因突變的速率，加速細(xì)胞增殖。其中AKT對腫瘤細(xì)胞能量代謝的調(diào)控起到最主要的作用，尤其是對腫瘤細(xì)胞的經(jīng)典代謝方式即Warburg效應(yīng)的影響[5,6]。

另外，在正常的快速增殖細(xì)胞如處于快速分裂狀態(tài)的胚胎細(xì)胞，也有糖酵解增強(qiáng)的現(xiàn)象[3]，這暗示著腫瘤細(xì)胞可能采用類似于胚胎細(xì)胞的某些生長策略來實現(xiàn)其快速增殖的目的。

腫瘤微環(huán)境不僅為腫瘤生長提供適宜條件，還是腫瘤與微環(huán)境相互作用的場所[7,8]。乳酸作為糖酵解的最終產(chǎn)物，也是一種微環(huán)境因子。乳酸化是實體腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象。LDH的表達(dá)與腫瘤的分化增殖、細(xì)胞遷移及浸潤侵襲也有著密切的關(guān)聯(lián)。有文獻(xiàn)表明，腫瘤的酸性微環(huán)境與細(xì)胞骨架間存在著某些聯(lián)系[9,10]。非肌細(xì)胞肌球蛋白II是細(xì)胞骨架的重要組成成分。作為分子馬達(dá)蛋白家族中的一員，它不僅為細(xì)胞的運(yùn)動提供動力，還參與細(xì)胞的各種生理活動，如細(xì)胞遷移與粘附、胞質(zhì)分裂、囊泡分泌等。NMII是一個六聚體的結(jié)構(gòu)，由重鏈(NMHC)和輕鏈(NMLC)組成，其中NMLC對NMHC起著穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用，NMHC通過磷酸化活化調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動。NMHCII可根據(jù)重鏈不同分為NMHCIIA，NMHCIIB和NMHCIIC三種亞型。我們課題組前期工作表明，在乳腺癌組織和乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，均存在NMHCIIA和NMHCIIB兩個亞型，這兩種亞型在乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲等起始階段，均起著重要的調(diào)控作用，且NMHCIIA影響NMHCIIB的表達(dá)。已有研究表明非肌細(xì)胞肌球蛋白重鏈IIA磷酸化(S1943)可引起乳腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移[11]。而乳酸對腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控是否與NMHCIIA有關(guān)，尚未見報道。

我們篩選收集吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系2010年1月至2016年7月乳腺活檢的85例病例作為研究對象，在乳腺增生、乳腺纖維腺瘤、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌三類標(biāo)本中，對AKT、乳酸關(guān)鍵酶LDH及NMHCIIAp-S1943進(jìn)行免疫組化染色后，觀察統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：AKT、 LDH、NMHCIIA p-S1943均定位于增生細(xì)胞、瘤細(xì)胞，癌細(xì)胞的胞漿/胞膜中，且乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中AKT、LDH、NMHCIIA p-S1943表達(dá)量最高，乳腺纖維腺瘤次之，乳腺增生組織表達(dá)量最少，且組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明AKT、LDH、NMHCIIAp-S1943可能在乳腺組織癌變的過程中發(fā)揮重要作用。

乳腺組織標(biāo)本AKT、LDH的免疫組化染色結(jié)果平均IOD值，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得出兩者的相關(guān)系數(shù)r=0.958，P<0.005，具有統(tǒng)計學(xué)意義，乳腺組織中AKT和LDH表達(dá)成正相關(guān)。LDH、NMHCIIA p-S1943的免疫組化染色結(jié)果平均IOD值，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得出兩者相關(guān)系數(shù)r=0.927，P<0.005，具有統(tǒng)計學(xué)意義，LDH和NMHCIIAp-S1943表達(dá)成正相關(guān)。 由此發(fā)現(xiàn)，三者間應(yīng)發(fā)揮著一定的協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

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TheexpressionandcorrelationofAKT,LDHandNMHCIIAinbreasttissue

WANGRuo-bing,YESi-yang,LIDong-dong,etal.

(KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo examine the expression and correlation of AKT, LDH and NMHCIIAp-S1943 in breast tissue.MethodsThe expression of AKT,LDH and NMHCIIAp-S1943 in 25 cases of cyclomastopathy,25 cases of breast fibroadenoma and 35 cases of invasive ductal carcinoma of the breast (IDCB) was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of AKT in cyclomastopathy,breast fibroadenoma and invasive ductal carcinoma of the breast rises in turn.Namely,as the degree of malignancy increases,the expression of AKT increases.Similar results were obtained by the expression analysis of LDH and NMHCIIAp-S1943.In breast tissue,the expression of AKT is positively correlative with that of LDH(P<0.005).The expression of LDH is also positively correlative with that of NMHCIIAp-S1943(P<0.005).ConclusionAKT,LDH and NMHCIIAp-S1943 respectively play a significant part in cancerous progress of breast tissue,and there is correlation between AKT,LDH and NMHCIIA p-S1943.

breast cancer;AKT;LDH;NMHCIIA;tumor microenvironment;immunohistochemistry

R737.9

A

2016-11-14)

吉林省科技廳國際合作處項目(20160414023GH);吉林省科技廳重點科技攻關(guān)項目(20150204066SF)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1687-03