胡祖良 張?jiān)待?鄭敏 黃小春 趙建 張東泉?

米諾環(huán)素對(duì)全氟異丁烯吸入性急性肺損傷的防治效果

胡祖良 張?jiān)待?鄭敏 黃小春 趙建 張東泉?

目的 觀察米諾環(huán)素（MIN）對(duì)大鼠全氟異丁烯（PFIB）吸入性急性肺損傷（ALI）的防治效果，為尋找防治PFIB中毒的有效藥物提供理論根據(jù)。方法 用自制大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入染毒系統(tǒng)構(gòu)建大鼠PFIB吸入性ALI模型。觀察MIN治療組與中毒對(duì)照組肺系數(shù)以及支氣管肺灌洗液（BALF）中蛋白及磷脂含量變化。結(jié)果 MIN在PFIB染毒后1h 腹腔注射給藥可以減輕肺損傷，但對(duì)BALF中蛋白質(zhì)和磷脂含量無影響。結(jié)論 MIN治療PFIB吸入性ALI可以減輕PFIB染毒大鼠的肺損傷，減輕肺間質(zhì)瘀血水腫的程度，但并未減少肺泡腔內(nèi)液體滲出。

全氟異丁烯 急性肺損傷 米諾環(huán)素

鹽酸四環(huán)素治療能夠顯著改善全氟異丁烯（perfluoroisobutylene，PFIB）吸入性急性肺損傷（acute lung injury，ALI），且能劑量依賴性的抑制肺組織和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中MMP-2活性，其中高劑量鹽酸四環(huán)素治療可使肺組織中MMP-2活性降低至正常水平［1-2］。因此針對(duì)蛋白分解酶的抑制藥物可能在治療PFIB吸入性肺損傷中發(fā)揮作用。由于鹽酸四環(huán)素的毒性不良反應(yīng)，我國目前已近于淘汰，2016年1月至6月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，觀察米諾環(huán)素（minocycline，MIN）對(duì)PFIB吸入致大鼠ALI的防治效果，以期為尋求ALI 有效治療藥物提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PFIB（上海有機(jī)氟材料研究所，純度：98%）；BSA224S 分析天平（德國Sartorius 公司）；MIN（純度99%）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d，自由飲食飲水，每籠飼養(yǎng)6只，于染毒前禁食1夜。

1.3 方法 將36只大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，即：正常對(duì)照組（NC組），在空氣暴露后1h，腹腔注射（1.0ml/100g BW）生理鹽水；MIN藥物對(duì)照組（MIN-C），在空氣暴露后1h，腹腔注射中劑量MIN（31.5 mg/kg BW）；PFIB+NS組（PFIB-C），在PFIB染毒后1h，腹腔注射（1.0ml/100g BW）生理鹽水；PFIB+MIN低劑量組（MIN-L）：在PFIB染毒后1h，腹腔注射低劑量MIN（15.75 mg/kg BW）；PFIB+MIN中劑量組（MIN-M），在PFIB染毒后1h，腹腔注射中劑量MIN（31.5 mg/kg BW）；和PFIB+MIN高劑量組（MIN-H），在PFIB染毒后1h，腹腔注射高劑量MIN（63 mg/kg BW）。染毒前及染毒后24h稱量動(dòng)物體質(zhì)量并記錄。大鼠動(dòng)態(tài)吸入PFIB 周身暴露染毒裝置及PFIB 染毒濃度的測(cè)定方法見文獻(xiàn)［2］。

1.4 觀測(cè)指標(biāo) （1）肺系數(shù)測(cè)定：在PFIB染毒后24h，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死。待血液排凈后，打開胸腔，分離出氣管并于氣管分叉處結(jié)扎右支氣管，將右肺及右肺副葉全部取出，剔除肺外組織，生理氯化鈉漂洗，濾紙吸干后測(cè)量濕肺凈重。計(jì)算肺系數(shù)：濕肺/體比=（濕肺凈重/體質(zhì)量）×10000。（2）BALF的制備及蛋白和磷脂含量測(cè)定：在取出右肺后，經(jīng)左支氣管插管，參照文獻(xiàn)所述方法制備BALF。Lowry法測(cè)BALF中總蛋白含量，采用Wako公司磷脂試劑盒測(cè)定磷脂含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較用方差分析；組間兩兩比較用Dunnet' t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFIB染毒前后大鼠肺組織大體病理學(xué)觀察 在PFIB亞致死劑量染毒后24 h，解剖動(dòng)物時(shí)，肉眼可見，PFIB對(duì)照組受試動(dòng)物全肺呈現(xiàn)彌漫性水腫、瘀血表現(xiàn)，而在PFIB染毒后1h給予MIN治療，雖然低劑量組大鼠肺部瘀血、水腫等仍然表現(xiàn)嚴(yán)重，但隨MIN給藥劑量增加，逐漸減輕，但肺體積仍較正常對(duì)照組大。見圖1。

圖1 MIN治療PFIB染毒后大鼠肺組織照片

2.2 MIN治療對(duì)PFIB吸入性肺損傷的作用-肺質(zhì)量和肺系數(shù)結(jié)果 在MIN給藥劑量為15.75～63 mg/kg范圍，雖然MIN-L組的肺重量與染毒對(duì)照組相比無明顯變化，但隨著給藥劑量的增加，MIN可以劑量依賴性的降低濕肺重、濕肺體比。見圖2。

圖2 MIN治療PFIB染毒大鼠的肺質(zhì)量與肺系數(shù)變化

2.3 MIN治療對(duì)PFIB吸入性肺損傷的作用- BALF中蛋白和磷脂含量的變化 BALF中蛋白質(zhì)和磷脂含量變化與肺質(zhì)量變化不同，即在MIN給藥劑量為15.75～63 mg/kg的范圍內(nèi)，MIN治療組BALF中蛋白質(zhì)和磷脂含量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)性變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 MIN治療PFIB染毒大鼠的肺勻漿及BALF中蛋白磷脂含量的變化

3 討論

米諾環(huán)素是一種化學(xué)修飾的四環(huán)素，它特異性的增強(qiáng)和保留了非抗生素的作用，具有抗氧化，抑制細(xì)胞因子合成，還可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤，抑制缺血再灌注后細(xì)胞凋亡，且也是一種廣譜的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑［3-4］，含氟化學(xué)品應(yīng)用廣泛，但在生產(chǎn)和加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量氣態(tài)劇毒化學(xué)物質(zhì)，PFIB是全氟丁烯的一種異構(gòu)體，多見于火災(zāi)等意外事故生成的有毒煙霧中［5］。研究表明少量吸入PFIB會(huì)引起頭痛、咳嗽、胸痛、呼吸困難和發(fā)熱等癥狀，產(chǎn)生ALI，嚴(yán)重者可致死亡［6-7］。研究表明，蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡在ALI發(fā)病過程中具有重要的作用和地位［8］。主要是ALI時(shí)肺局部聚集的中性粒細(xì)胞釋放過量的蛋白分解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶［9］（matrix metalloproteinases，MMPs）和炎性因子如IL-6、IFN-γ 和 TNF-α 等所致［10-11］。

PFIB 吸入性肺損傷是由于中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，活化，釋放蛋白酶、細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致血管通透性增加，損傷肺泡上皮屏障，導(dǎo)致Ⅰ、Ⅱ型肺泡細(xì)胞的損傷壞死，肺氣血屏障通透性升高，形成肺損傷，進(jìn)而發(fā)展成為肺水腫。研究顯示在急性肺損傷組織中被激活的炎癥細(xì)胞釋放的各種組織損傷因子中，MMPs與細(xì)胞凋亡被認(rèn)為與ALI 密切相關(guān)。MIN是膠原酶和明膠酶的抑制劑，也是細(xì)胞凋亡抑制劑。Muroya M等研究表明MIN可以減少上皮細(xì)胞損傷后的細(xì)胞凋亡［12］；Greenwald等研究表明MIN可以顯著性抑制RA患者的滑膜組織培養(yǎng)液中的膠原酶活力［13］；Bhatt LK等在心臟缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可以通過抑制MMP-2和MMP-9活性，從而減輕肺損傷［14］，作者認(rèn)為MIN可能通過抑制MMP-2和MMP-9酶活性及表達(dá)，減少肺屏障細(xì)胞的凋亡，減輕肺損傷。本資料中肺濕干重比是反映肺組織損傷程度的良好指標(biāo)，MIN治療組的肺系數(shù)顯著低于PFIB-C 組，且BLAF中蛋白質(zhì)和磷脂含量也出現(xiàn)類似趨勢(shì)性變化，提示中、高劑量MIN可以減輕PFIB誘導(dǎo)的ALI 的病變嚴(yán)重程度，抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，蛋白酶抑制劑MIN可減輕PFIB吸入性ALI，降低ALI 的嚴(yán)重程度，其機(jī)制可能預(yù)期抑制ALI 時(shí)炎癥介質(zhì)釋放，抑制細(xì)胞凋亡，減輕肺泡上皮屏障損傷，減輕失控性的炎癥反應(yīng)有關(guān)。對(duì)于尋找專一性較強(qiáng)的酶抑制劑，會(huì)明顯提升PFIB 吸入性肺損傷的防治能力，并有利于推進(jìn)PFIB吸入性肺損傷發(fā)病機(jī)制的研究。

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Objective To observe the therapeutic effect of minocycline（MIN）on acute lung injury（ALI）induced by perfluoroisobutylene（PFIB）-inhaled in the rat and to provide theoretical basis for treatment of ALI induced by PFIB. Methods The Wistar rats were exposed to gaseous PFIB in a whole body exposure system，the lung coefficient，protein content and phosphatide content of bronchial veolar lavage fluid（BALF）in PFIB-inhaled rats were measured. Results The ALI was significantly alleviated when PFIB was inhaled 1 hour later，but the protein content and phosphatide content in BALF were not significantly reduced. Conclusion MIN can reduce the degree of pulmonary interstitial edema，but can’t reduce alveolar liquid leakage.

Perfluoroisobutylene Acute lung injury Minocycline

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y13H240001）；平湖市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016072）；衢州市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013090）

324004 浙江衢化醫(yī)院（胡祖良 張東泉 鄭敏）100850 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所（趙建）314000 浙江省平湖市第二人民醫(yī)院（張?jiān)待?黃小春）

*通信作者