伍萬 江榮林? 歐陽侃 葉遠玲

腸型脂肪酸結(jié)合蛋白對膿毒癥大鼠早期急性腸損傷診斷研究

伍萬 江榮林? 歐陽侃 葉遠玲

目的 探討腸型脂肪酸結(jié)合蛋白對膿毒癥大鼠早期急性腸損傷的診斷意義。方法 將120只大鼠隨機分為假手術(shù)組、3h膿毒癥模型組、6h膿毒癥模型組、12h膿毒癥模型組，每組各30只。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥大鼠模型，假手術(shù)組大鼠僅開腹而不行CLP。各組大鼠于造模后經(jīng)尾靜脈推注生理鹽水1ml/100g液體復蘇。將其分別裝入大鼠代謝籠內(nèi)收集尿液。3h、6h、12h后取血并處死大鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清內(nèi)毒素、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（IFABP）、D-二乳酸（D-LAC）及尿IFABP表達；采用細菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)淋巴結(jié)、肝臟、脾臟細菌移位量；光鏡下觀察腸黏膜組織病理學改變進行chiu評分；采用原位末端缺刻記法（TUNEL）檢測腸黏膜上皮細胞凋亡指數(shù)（AI）。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測IFABP蛋白、ZO-1蛋白表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，M3、M6、M12組中血、尿IFABP、內(nèi)毒素和FITC-G表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且M3、M6、M12各組間相互比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而M3 D-LAC表達水平增高不明顯，與假手術(shù)組無統(tǒng)計學意義，M6、M12組D-LAC表達水平明顯增高，與假手術(shù)組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且各組間有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；細菌移位表達：3h淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)現(xiàn)有細菌移位，6h肝臟發(fā)現(xiàn)細菌移位，而脾臟在本實驗時間窗內(nèi)未發(fā)現(xiàn)細菌移位。6h淋巴結(jié)內(nèi)細菌移位比3h明顯（P＜0.01），12h淋巴結(jié)、及肝臟內(nèi)細菌移位率進一步增多，與6h比較有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。HE染色和腸黏膜細胞凋亡：3h、6h、12h腸黏膜損傷評分及細胞凋亡明顯增高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），6h腸黏膜損傷評分及細胞凋亡比3h更顯著（均P＜0.01），12h腸黏膜損傷評分及細胞凋亡進一步增多，與6h相比有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；ZO-1、IFABP蛋白表達：M3、M6、M12中ZO-1表達水平逐漸減少，而IFABP蛋白表達水平逐漸增高，與假手術(shù)組有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），且各組間比較有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。結(jié)論 IFABP對膿毒癥大鼠急性腸損傷有較好的相關性，其對急性腸損傷的診斷有較好的敏感性和特異性。

IFABP 膿毒癥 急性腸損傷

急性腸損傷是指危重患者急性疾病引起的急性腸功能障礙。在膿毒癥中，炎癥介質(zhì)的釋放，缺血再灌注損傷、腸道微生態(tài)失衡及谷氨酰胺缺乏均能造成腸黏膜屏障的損傷，進而誘發(fā)腸道內(nèi)細菌、毒素及各種代謝產(chǎn)物的移位，使膿毒癥進一步加重，甚至誘發(fā)多器官功能障礙綜合征。腸型脂肪型結(jié)合蛋白（IFABP）又稱為腸上皮細胞蛋白。當腸上皮細胞受到損傷時，上皮細胞內(nèi)的小分子胞漿蛋白IFABP從細胞內(nèi)流入體循環(huán)中，所以血漿中IFABP表達水平會增高，研究認為IFABP是目前提示腸道早期缺血性損害的理想生物標記物之一［1］。本文探討IFABP表達水平與腸損傷程度和內(nèi)毒素血癥及細菌移位的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 購入120只SD大鼠。大鼠內(nèi)毒素、IFABP、D-LAC ELISA試劑盒，購自上海西唐生物科技有限公司；大鼠血清內(nèi)毒素、IFABP、D-LACELISA測定：具體操作按照試劑盒說明進行。

1.2 方法 120只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham）、3h 模型組（M3）、6h 模型組（M6）、12h 模型組（M12），每組各30只。采用盲腸結(jié)扎穿孔方法［2］制備膿毒癥模型。經(jīng)水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉后，腹部皮膚去毛，碘伏消毒。超凈工作臺內(nèi)，于大鼠腹腔前正中線作長約2～3cm切口，游離腸系膜和盲腸，在盲腸以3號絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸大部，注意避開盲腸動、靜脈，避免損傷腸系膜血管，結(jié)扎完畢仔細檢查，保持腸道通路通暢。在距盲腸末端約1cm處用18號針頭穿刺2處，針孔之間相距約1cm，輕柔擠壓腸管使糞便自穿刺點溢出，留置一條寬2mm的橡皮條，防止針孔閉合。還納腸管，逐層縫合關腹。術(shù)后皮下注射生理鹽水3ml/100g體重行液體復蘇。Sham組僅行開關腹手術(shù)而不行盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)。膿毒癥（CLP）：開腹手術(shù)后結(jié)扎穿孔盲腸，經(jīng)大鼠尾靜脈推注生理鹽水行液體復蘇（1ml/100g）。繼而清潔喂養(yǎng)。M3、M6、M12分別于3h、6h、12h后經(jīng)水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉后，經(jīng)腹主動脈采集血液，大鼠代謝籠收集尿液，在無菌條件下收集腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟臟器進一步檢查。

1.3 病理學檢測 小腸HE染色：取上述回腸組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，依據(jù)HE染色步驟，觀察小腸組織病理學改變。根據(jù)Chiu腸黏膜損傷評分［6］，對小腸黏膜損傷程度進行分級。

1.4 細菌移位檢測 在無菌條件下，遵循無菌操作原則，取SD大鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟，電子天平稱稱質(zhì)量后按1：100（kg/L）的比例加入無菌生理鹽水，勻漿取0.1ml組織勻漿接種至血瓊培養(yǎng)板，用L型玻棒涂均勻后，置于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24～48h，計算細菌菌落數(shù)。組織細菌菌量（CFUs/g）=菌落數(shù)×1000。如＞100個/g，即為陽性。

1.5 腸通透性檢測 術(shù)后12h，經(jīng)水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉后，取回盲部以上20cm小腸用4-0絲線兩端結(jié)扎而不影響該段腸血供，由該腸段遠端注入濃度為25mg/ml、相對分子量為4000的異硫氰酸熒光素（FITC）標記的葡聚糖溶液1ml，60min后取3ml血，離心10min，取血漿用熒光酶標儀分析FITC-G，標準曲線用PBS稀釋的FITC標記的葡聚糖獲得，以葡聚糖通過率反映腸道通透性。

1.6 腸上皮細胞凋亡檢測 采用TUNEL檢測法，判斷凋亡的發(fā)生，具體操作按照試劑盒說明進行。

1.7 Western blot檢測IFABP、ZO-1蛋白 取上述空腸組織20mg剪切成細小的碎片，加入200μl RIPA裂解液，用勻漿器勻漿，12000r/min，4℃，離心5min，取上清液，以BCA（bicinchonininc acid）法測蛋白濃度。剩余上清液加入1/4體積的5×Loading buffer 上樣緩沖液，于沸火中煮沸3～5 min進行蛋白變性。取30μg總蛋白上樣行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓力100V，90min，電泳后將分離出蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，T-TBS緩沖液（10mmol/L Tris-HCL，pH 7.4，150mmol/L NaCL，0.05%Tween20）清洗膜3次，每次30 min，加入多克隆兔抗IFABP、ZO-1抗體（一抗）（1：500）4℃過夜，T-TBS緩沖液洗膜3次，30min/次，加入HRP標記的山羊抗體兔抗（二抗）孵育2h，T-TBS緩沖液洗膜3次，30min/次，后加入ECL化學發(fā)光劑，放入暗盒中曝光，以β-actin作為內(nèi)參。膠片用BIO-RAD凝膠系統(tǒng)成像，用quantity one 軟件對條帶進行半定量分析。IFABP蛋白含量=樣本IFABP、ZO-1蛋白灰度值/同一樣本β-actin灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（x±s）表示，多樣本比較用方差分析，方差齊用SNK-q和Dunnett-t檢驗，方差不齊用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素與尿液中IFABP表達 見表1。

表1 類毒素與尿中IFABP表達水平［μg/ml，（x±s）］

2.2 血清IFABP與D-LAC、FITC-G表達 見表2。

表2 血清IFABP與D-LAC表達水平［μg/ml，（x±s）］

2.3 細菌移位率 見表3。

表3 腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾細菌移位［CFUs/g，（x±s）］

2.4 腸HE染色和上皮細胞凋亡 見表4。

表4 腸HE染色和上皮細胞凋亡（x±s）

2.5 緊密連接蛋白ZO-1、及IFABP蛋白表達 見表5。

表5 緊密連接蛋白ZO-1、IFABP蛋白表達

3 討論

內(nèi)毒素是由革蘭陰性細菌所分泌的毒素，腸道內(nèi)存在大量革蘭陰性細菌，正常腸道環(huán)境遭受破壞后，革蘭陰性細菌大量生長繁殖，并釋放出大量內(nèi)毒素入血。IFABP是哺乳動物組織細胞液中的一組低分子質(zhì)量（12-15KD）的蛋白質(zhì)，I-FABP主要位于絨毛的頂端，具有較好的器官特異性，黏膜中的含量最為豐富，絨毛處的含量高于陷窩。小腸缺血時，腸黏膜對缺血狀態(tài)比較敏感，黏膜絨毛最先受累，因此腸缺血時IFABP較早釋放入血。在正常情況下，IFABP在血清中含量微乎其微，腸缺血時IFABP能較早釋放，且在缺血時細胞膜的通透性增大，其分子可以通過細胞膜面釋放入血［3］。有研究證實［4］，血清IFABP是一種腸黏膜早期損傷非常敏感且特異好的生化指標。本實驗發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥初期，類毒素表達水平增高（P＜0.01），同時血清中IFABP也增高（P＜0.01），腸通透性指標FITC-G也同時增多（P＜0.01），小便中I-FABP也相應增高（P＜0.01），6h后三者繼續(xù)增高（P＜0.01），12h后進一步升高（P＜0.01），類毒素作為反映全身炎癥反應綜合征敏感指標之一，其增高表明該實驗膿毒癥模型制備成功，隨著時間的推移，類毒素表達水平逐步增高，作者認為在發(fā)生膿毒癥時，類毒素會激活白細胞系統(tǒng)、單核巨噬細胞系統(tǒng)、補體系統(tǒng)，引起促炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素素1（IL-1）、白介素 6（IL-6）、白介素 8（IL-8）、血小板激活因子（PAF）等相互激活和相互放大，使腸道微循環(huán)發(fā)生改變，損害腸道黏膜，腸道黏膜絨毛發(fā)生斷裂、凋亡、壞死等，腸道通透性增高。因此，在血液中可以檢測出I-FABP、D-LAC及FITC-G表達。D-LAC是腸道中細菌產(chǎn)生的透過受損的腸黏膜經(jīng)毛細血管進入血液循環(huán)，血清中D-LAC表達水平會升高［5］，同時腸黏膜低灌注導致腸道黏膜通透性持續(xù)性升高，最終引起血漿D-LAC水平持續(xù)性升高。

本資料結(jié)果顯示，3h光鏡下腸黏膜絨毛有破損，腫脹明顯，輕度潰瘍形成，血管周圍輕度出血，有少量中性粒細胞浸潤，腸道黏膜上皮細胞凋亡明顯增多，腸道屏障遭受破壞；6h及12h上述損傷進一步加重，且6h凋亡進一步增多，12h后凋亡率為3h的1倍。隨著時間的推移，腸屏障中的緊密連接蛋白ZO-1條帶逐漸變窄變細，IFABP蛋白表達量隨著膿毒癥模型時間推移逐步升高，與血清中IFABP表達量相一致，從而進一步表明腸道損傷時釋放出IFABP，且表達量與腸組織損傷程度及上皮細胞凋亡嚴重程度有關聯(lián)。

本資料結(jié)果顯示，IFABP經(jīng)腎臟代謝，在小便中同樣可以檢測IFABP的表達，這是由于IFABP分子量小，半衰期短，易通過腎臟代謝。在膿毒癥早期，D-LAC表達稍有增高，但與模型組比較增高不明顯（P＞0.05），在6h后才明顯增高，而IFABP在膿毒癥的早期表達水平明顯升高，IFABP能更好的反映早期腸道發(fā)生損傷，與D-LAC相比，其敏感性更高，本資料結(jié)果與石卉［6］等在大鼠急性腸缺血模型中血清腸脂肪酸結(jié)合蛋白和D-LAC濃度與缺血時間和腸道損傷的相關性分析相一致。且IFABP與急性腸損傷呈正相關［7］。

本資料顯示，在早期腸系膜淋巴結(jié)能培養(yǎng)出細菌，而肝臟未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出細菌，但在6h時肝臟培養(yǎng)出細菌，隨著時間的推移，腸系膜淋巴結(jié)、肝臟細菌移位量明顯增多，而脾臟未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出細菌。檢測出的細菌96%為革蘭陰性桿菌，主要是大腸埃希菌、變形桿菌、克雷伯桿菌等。本資料顯示，IFABP升高時間與細菌移位量升高時間相同，且IFABP升高與細菌的移位量呈正相關，表明腸道損傷越嚴重，細菌毒素更易通過損傷腸屏障入血進入淋巴結(jié)和遠處臟器。在膿毒癥后期有繼發(fā)腸源性感染，腸腔內(nèi)大腸桿菌及內(nèi)毒素進入血液循環(huán)，激活巨噬細胞系統(tǒng)，炎癥因子釋放，構(gòu)成“第二次打擊”，促進全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙的發(fā)生［8］。

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Objective To discuss intestinal fatty acid binding protein for the diagnosis in septic rats with acute intestinal injury.Methods Severe sepsis was established by cecal ligation and puncture（CLP）in 30 healthy Sprague-Dawley rats. Thirty rats that

sham surgery received 10ml/kg of normal saline. Rats（n=90）with CLP were randomized to receive 10ml/kg of normal saline. Rats were killed after 3 hours，6 hours and 12 hours .Serum levels of endotoxin，intestinal fatty acid binding protein，D-lac and urine intestinal fatty acid binding protein were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The lymph node，liver，spleen were bacteria cultured by bacteria culture assay. Ileum tissue structure and pathological score were observed by microscopy. Ileal mucosal epithelial cell apoptosis index was calculated by TUNEL assay. And tight junction transmembrane protein zo-1 and intestinal fatty binding protein were measured by immunohistochemistry and immunoblot. Results The level of serum and urine intestinal fatty acid binding protein，endotoxin，bacteria culture of the lymph node，F(xiàn)ITC-G，ileum pathological score，apoptosis index of ileal mucosal epithelial cells，and intestinal fatty acid binding protein level were significantly higher in the M3 group than in the sham group（P＜0.01）.The level of serum and urine intestinal fatty acid binding protein，endotoxin，D-LAC，bacteria culture of the lymph node and liver FITC-G，ileum pathological score，apoptosis index of ileal mucosal epithelial cells，and intestinal fatty acid binding protein level were significantly higher in the M6 group than in the M3 group（P＜0.01）. The level of serum and urine intestinal fatty acid binding protein，endotoxin，D-LAC，bacteria culture of the lymph node and liver，F(xiàn)ITC-G，ileum pathological score、apoptosis index of ileal mucosal epithelial cells，and intestinal fatty acid binding protein level were significantly highest in the M6 group（P＜0.01），Z0-1 protein lever were significantly lower in the M3 group than the sham group（P＜0.01）.ZO-1 protein lever were significantly lower in the M6 group than the M3 group（P＜0.01）. ZO-1 protein lever were significantly least in the M12 group.Conclusion IFABP has a very good correlation for acute intestinal injury with sepsis rat，its good value to diagnosis acute intestinal injure.

IFABP Sepsis Acute intestinal injure

浙江省衛(wèi)生廳項目（2014KYB211）

310006 杭州市中醫(yī)院（伍萬 歐陽侃 葉遠玲）310006浙江省中醫(yī)院（江榮林）*通信作者