顧超 劉元順 呂云 曹林峰 李亞清 李娜

·論著·

Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡在肺氣腫大鼠肺功能下降中的作用研究

顧超 劉元順 呂云 曹林峰 李亞清 李娜

目的 探討Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）凋亡在被動(dòng)吸煙肺氣腫大鼠肺功能下降中的相關(guān)作用。方法 選取90只清潔級(jí)雄性SD大鼠，完全隨機(jī)平均分成6組，A組正常對(duì)照組，B、C、D、E、F組大鼠被動(dòng)吸入不同濃度香煙煙霧。采用小動(dòng)物肺功能儀測(cè)定各組大鼠肺功能、肺組織病理學(xué)檢測(cè)、Real-time PCR測(cè)定肺泡表面活性蛋白A（SPA）和SPC mRNA水平、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SPA和SPC蛋白表達(dá)水平，TUNEL與SPC雙重免疫熒光染色分析AECⅡ凋亡情況。結(jié)果 當(dāng)香煙煙霧中一氧化碳（CO）濃度達(dá)到（300±10）ppm以上時(shí)，大鼠肺功能中氣道阻力（AR）明顯增加、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）及呼氣峰值流速（PEF）降低（P＜0.05）；大鼠肺組織出現(xiàn)明顯肺氣腫樣表現(xiàn)，肺泡平均內(nèi)襯間隔（MLI）和平均肺泡面積（MAA）顯著增加（P＜0.05）；肺組織中SPA和SPC mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），AECⅡ凋亡百分比顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論 AECⅡ凋亡在被動(dòng)吸煙建立的大鼠肺氣腫發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

被動(dòng)吸煙 肺泡 上皮細(xì)胞 凋亡 大鼠

據(jù)預(yù)計(jì)到2020年，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）將是全球死亡原因的第三位因素［1］。肺彈性組織的降解、肺泡結(jié)構(gòu)破壞與丟失、氣腔的擴(kuò)大是引起肺氣腫或COPD患者氣流受限的重要原因［2］。吸煙是引起肺氣腫和COPD的最主要危險(xiǎn)因素。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（type II alveolar epithelial cells，AECⅡ）作為AECI的祖細(xì)胞，具有合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)（surfactant protein，SPs）、維持肺泡內(nèi)外液體平衡、免疫調(diào)節(jié)等作用［3］，在維持正常肺泡內(nèi)穩(wěn)態(tài)和肺組織損傷修復(fù)中具有十分重要的意義［4］。2016年8月至12月作者采用不同被動(dòng)吸煙濃度建立肺氣腫大鼠模型，分析其肺功能變化及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 （1）動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，體重180～200 g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK滬2008-0016），飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)溫度21℃～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，12h明暗交替。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。（2）主要試劑： TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒（日本TaKaRa公司），兔抗大鼠肺表面活性蛋白（SP）A及SPC抗體、羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），TUNEL凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天公司），雄獅牌香煙（浙江中煙工業(yè)有限公司），DAPI（美國(guó)Sigma公司）。引物序列由上海Invitrogen公司合成（見(jiàn)表1）。

表1 引物序列

1.2 方法 （1）建立肺氣腫大鼠模型：將90只大鼠完全隨機(jī)平均分為6組，參照文獻(xiàn)［5-6］方法，采用被動(dòng)吸煙建立肺氣腫大鼠模型。每天將B組、C組、D組、E組、F組大鼠分別置于不同的自制吸煙箱（60cm×50cm×40cm）中，每只吸煙箱點(diǎn)燃香煙數(shù)不同，保證B組CO濃度維持在（200±11）ppm、C組CO濃度維持在（300±10）ppm、D組CO濃度維持在（400±13）ppm、E組CO濃度維持在（500±15）ppm和F組CO濃度維持在（600±18）ppm，每次被動(dòng)吸煙時(shí)間90 min，7d/周，共12周。同時(shí)間段內(nèi)，將A組大鼠置于相同吸煙箱中吸入空氣。（2）大鼠肺功能測(cè)定：各組大鼠被動(dòng)吸煙12周完成后，采用小動(dòng)物肺功能儀（上海Alcott Biotech公司）測(cè)定各組大鼠肺功能，麻醉消毒后固定，切開(kāi)頸部皮膚，將氣管倒T型切開(kāi)，食道插管經(jīng)口插入食道中部，并連接壓力傳感器記錄食道壓（即胸腔負(fù)壓），Y型套管氣管插管后，分別連接至微型壓力傳感器和呼吸流量傳感器記錄氣道壓和呼吸流量。觀察食道壓、氣道壓和呼吸流量，采集信號(hào)良好的波形10min，通過(guò)MPA肺功能分析系統(tǒng)計(jì)算出氣道阻力（AR）、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）和呼氣峰值流速（PEF）并取平均值。（3）肺組織病理學(xué)檢測(cè)：各組大鼠完成肺功能檢測(cè)后立即用10%水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉處死各組大鼠，對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》標(biāo)準(zhǔn)。取各組大鼠左肺組織，于4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，常規(guī)脫蠟至水，行蘇木素-伊紅（HE）染色，肺組織病理半定量分析肺泡平均內(nèi)襯間隔（MLI，將每個(gè)視野正中為中心劃“十”字交叉線，計(jì)數(shù)經(jīng)十字交叉線的肺泡間隔數(shù)為Ns；測(cè)量十字線總長(zhǎng)度為L(zhǎng)，MLI=L/Ns）及平均肺泡面積（MAA，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的肺泡數(shù)，測(cè)量每個(gè)視野面積為TA，HE染色陽(yáng)性區(qū)域（肺實(shí)質(zhì)）面積為 PA，MAA =（TA-PA）/Na）。（4）Real-time PCR檢測(cè)SPA及SPC mRNA水平：收集各組大鼠右肺組織，以TRIzol提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，行Real-time PCR，以GAPDH為內(nèi)參；根據(jù)目的基因分別加入：2×SYBR? Premix Ex TaqⅡ 10μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl，上游引物（10μmol/L）0.8μl，下游引物（10μmol/L）0.8μl，cDNA 2μl，補(bǔ)充無(wú)菌去離子水至總體積為20μl，離心混勻，95℃預(yù)變性4 min（95℃ 10s，56℃ 30s，72℃ 30s，共 45 個(gè)循環(huán)）。以2-ΔΔCt分析目的基因相對(duì)表達(dá)差異。（5）免疫組化法檢測(cè)SPA和SPC蛋白表達(dá)：取各組大鼠左肺組織切片，常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性氧化酶后高壓抗原修復(fù)，山羊血清封閉，加入1∶500稀釋的SPA或SPC抗體孵育，加入1∶100稀釋的生物素標(biāo)記的抗兔IgG孵育，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，采用中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察拍照，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。SPA或SPC陽(yáng)性細(xì)胞百分比=SPA或SPC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/400個(gè)總細(xì)胞×100%。（6）TUNEL和SPC雙重免疫熒光染色：取各組大鼠左肺組織切片，TUNEL法原位標(biāo)記凋亡細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。組織切片常規(guī)脫蠟至水，不含DNase的蛋白酶K消化，滴加1∶500稀釋的SPC抗體孵育，后加入1∶200稀釋的FITC- IgG抗體，室溫孵育，漂洗后加入TUNEL檢測(cè)液避光孵育，DAPI復(fù)染，IX71熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察拍照。計(jì)算TUNEL和SPC雙陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，即AECⅡ凋亡百分比=TUNEL和SPC雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺功能改變 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比較［n=15，（x±s）］

2.2 肺組織病理學(xué)變化 各組大鼠肺組織常規(guī)HE染色結(jié)果顯示，B組未出現(xiàn)明顯的肺氣腫樣表現(xiàn)；C組、D組、E組和F組大鼠肺組織均出現(xiàn)肺氣腫征象：部分肺泡呈囊狀擴(kuò)張，肺泡腔不規(guī)則且大小不一，相同視野內(nèi)肺泡數(shù)目減少，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合。肺組織病理半定量分析，見(jiàn)表3。

2.3 SPA和SPC表達(dá)水平 見(jiàn)圖1、2。

2.4 AECⅡ凋亡變化 見(jiàn)圖3。

3 討論

圖1 各組大鼠肺組織SPA和SPC mRNA表達(dá)水平

圖2 各組大鼠肺組織SPA和SPC陽(yáng)性細(xì)胞百分比

圖3 各組大鼠肺組織AECⅡ凋亡百分比

COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病理改變累及氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管等結(jié)構(gòu)，且呈進(jìn)行性發(fā)展，目前尚無(wú)有效藥物阻止COPD患者肺功能長(zhǎng)期下降［1］。肺彈性組織的降解、肺泡結(jié)構(gòu)破壞與丟失、氣腔的擴(kuò)大是引起肺氣腫或COPD患者氣流受限的重要原因。吸煙是肺氣腫和COPD的主要危險(xiǎn)因素，與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，被認(rèn)為是COPD的常見(jiàn)致病因素［7］。本研究中，當(dāng)香煙煙霧中CO濃度維持在300±10 ppm時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)大鼠肺功能中AR增加、Cdyn及PEF降低；并且，大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的肺氣腫樣表現(xiàn)，MLI和MAA明顯增加，其嚴(yán)重程度與肺功能下降程度相一致。

哺乳動(dòng)物的肺泡上皮細(xì)胞由I型肺泡上皮細(xì)胞（AECI）和AECⅡ組成。AECⅡ不僅可分化為AECI，還可通過(guò)有絲分裂補(bǔ)充自身數(shù)量；同時(shí)AECⅡ還具有合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)（SPs）、維持肺泡內(nèi)外液體平衡、免疫調(diào)節(jié)等作用［3，8］。肺泡表面活性物質(zhì)包括SPA、SPB、SPC和SPD，可由肺泡上皮中的AECⅡ合成和分泌。SPA和SPC是特異性地由AECⅡ分泌［9-10］，在減小肺泡表面張力中起重要作用。AECⅡ作為AECI的祖細(xì)胞，其嚴(yán)重受損或丟失將導(dǎo)致肺泡受損及肺泡修復(fù)障礙。本資料中，被動(dòng)吸煙建立大鼠肺氣腫模型，大鼠肺組織中SPA和SPC mRNA和蛋白水平顯著下降，其下降程度與大鼠肺功能下降及肺組織肺氣腫樣改變程度相一致，提示AECⅡ存在一定程度的受損；進(jìn)一步采用TUNEL和SPC雙重免疫熒光染色法，結(jié)果表明肺氣腫大鼠肺組織存在明顯的AECⅡ凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠肺功能下降并出現(xiàn)明顯的肺氣腫樣表現(xiàn)，最終出現(xiàn)不可逆肺損傷。但隨著煙霧中CO濃度的持續(xù)升高，大鼠肺功能、病理學(xué)改變及SPA和SPC 的表達(dá)不再惡化。作者認(rèn)為可能的原因主要是：在被動(dòng)吸煙過(guò)程中，隨著煙霧中CO濃度的升高，大鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神狀態(tài)萎靡及呼吸頻率減慢，可能出現(xiàn)呼吸抑制，進(jìn)而可能導(dǎo)致在高CO濃度時(shí)大鼠吸入的總顆粒物等有害物質(zhì)并未明顯增多，最終出現(xiàn)肺功能不再繼續(xù)下降，病理學(xué)改變、SPA和SPC表達(dá)及AECⅡ凋亡不再惡化。

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Objective To study the effects of type II alveolar epithelial cells apoptosis on pulmonary function decline in rats with emphysema.Methods Ninety SPF-grade male Sprague-Dawley rats were randomly sorted into six groups. A group was control group；rats form B，C，D，E and F groups were exposed to different passive smoking concentrations. Small animal lung function instrument was used to analyze the pulmonary function of each rat. Histological changes of rats were analyzed by H&E staining，and surfactant protein A（SPA）and SPC mRNA expressions were detected by Real-time PCR；SPA and SPC protein expressions were measured by immunohistochemical analysis. TUNEL/SPC immunofluorescence staining was used to analyze the apoptosis of type II alveolar epithelial cells（AECⅡ）. Results When the concentration of carbon monoxide（CO）in cigarette smoke was above 300±10 ppm，the airway resistance（AR）from rats was increased significantly，and the pulmonary dynamic compliance and peak expiratory flow were obviously decreased in lung function（P＜0.05）. Enlargement of airspace was observed and the amount of alveoli was decreased in the lung tissues，and the mean linear intercept and mean alveolar airspace from rats were significantly increased（P＜0.05）；SPA and SPC mRNA and protein expressions were markedly decreased（P＜0.05）；and the percentage of AECⅡ apoptosis was significantly increased（P＜0.05）.Conclusions AECⅡ apoptosis plays an important role in the development of emphysema in rats induced by passive smoking.

Passive smoking Pulmonary alveoli Epithelial cells Apoptosis Rats

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000016）；浙江省嘉興市第一醫(yī)院院級(jí)課題資助項(xiàng)目（2016-YA-01）；浙江省嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017AY33010）

314000 浙江省嘉興市第一醫(yī)院（顧超 曹林峰 李娜）310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（劉元順）311261 杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)骨傷科醫(yī)院（呂云）310014 浙江省人民醫(yī)院（李亞清）