張冰冰 ，楊威 ，徐闖 ，夏成 ，張洪友 ，王春仁 ，，余麗蕓

TGF-β參與細(xì)胞內(nèi)鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流調(diào)節(jié)FGF23的釋放

張冰冰1，楊威2，徐闖2，夏成2，張洪友2，王春仁1，2，余麗蕓1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

為了研究TGF-β是否通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流來(lái)調(diào)節(jié)FGF23的釋放，通過(guò)TGF-β處理大鼠骨肉瘤細(xì)胞利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FGF23和Orai1基因的表達(dá)。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組細(xì)胞比較，TGF-β處理組FGF23與Orai1的基因表達(dá)水平顯著升高，并且Orai1和NF-κB的抑制劑能夠拮抗TGF-β的作用。表明TGF-β通過(guò)NF-κB/Orai1調(diào)節(jié)FGF23的釋放，為進(jìn)一步治療慢性腎病等疾病提供依據(jù)。

TGF-β；成纖維生長(zhǎng)因子23；細(xì)胞內(nèi)鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流

成纖維生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF23）主要在骨組織中表達(dá)，尤其在成骨細(xì)胞中大量分泌[1]。FGF23是調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝的核心激素之一[2]，也是調(diào)控 1，25（OH）2D3形成的重要調(diào)節(jié)子，F(xiàn)GF23可分別通過(guò)抑制腎 1 α羥化酶和上調(diào)Cyp24a1 來(lái)減少 1，25（OH）2D3的形成[3]，進(jìn)而降低血液中 1，25（OH）2D3的含量[4-6]。 此外，F(xiàn)GF23 通過(guò)抑制腎小管對(duì)磷的重吸收，促進(jìn)腎磷酸鹽的排出[4]。FGF23 缺失導(dǎo)致血液中鈣、磷和 1，25（OH）2D3的水平大幅升高，導(dǎo)致機(jī)體急速衰老，生命周期銳減，而上述現(xiàn)象很可能是由于血管鈣化引起[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道NF-κB可激發(fā)UMR106細(xì)胞內(nèi)的Ca2+活性進(jìn)而調(diào)節(jié)FGF23的釋放[7]。在UMR106細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變主要是由Ca2+池操縱性Ca2+內(nèi)流（store-operated Ca2+entry，SOCE） 來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而膜蛋白Orai1則是SOCE的主要調(diào)控蛋白[8]。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β對(duì)成骨細(xì)胞的分化以及骨基質(zhì)特性有重要作用[9]，而且TGF-β也是重要的NF-κB調(diào)節(jié)子[10]。因此，該實(shí)驗(yàn)利用UMR106細(xì)胞，探究TGF-β是否介導(dǎo)NF-κB激發(fā)Orai1信號(hào)通路來(lái)調(diào)控FGF23的釋放。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Trizol，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBG real-time PCR kit均購(gòu)自Inventrogen公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FCS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。UMR106細(xì)胞經(jīng)1，25（OH）2D3（100 nM）預(yù)處理24 h促進(jìn)FGF23的表達(dá)，之后分別添加終濃度20 ng·mL-1的TGF-β到含有或不含有Orai1抑制劑YM58483（100 nM）和NFκB的抑制劑Wogonin（100 μM）細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)處理24 h。

1.2.2 熒光定量RT-PCR

細(xì)胞總RNA的提取按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定mRNA濃度，取1 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，QRT-PCR運(yùn)用SYBG染料法檢測(cè) FGF23，Orai1，NFκB65 的 mRNA 的表達(dá)水平[11]。根據(jù)GenBank中FGF23，Orai1，NFκB65和TBP mRNA序列，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物。QRT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）如下：SYBG10 μL，ddH2O 7 mL，上游引物（10 μM·L-1）、下游引物（10 μM·L-1）各 1 μL；cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性3 min，95℃10 sec and 58℃30 sec，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

Rat Tbp（TATA box-binding protein）：

forward（5'-3'）：ACTCCTGCCACACCAGCC

reverse（5'-3'）：GGTCAAGTTTACAGCCAAGATTCA

Rat Fgf23

forward（5'-3'）：TGGCCATGTAGACGGAACAC

reverse（5'-3'）：GGCCCCTATTATCACTACGGAG

Rat Orai1

forward（5'-3'）：CGTCCACAACCTCAACTCC

reverse（5'-3'）：AACTGTCGGTCCGTCTTAT

Rat NFκB p65

forward（5'-3'）：TTCCCTGAAGTGGAGCTAGGA

reverse（5'-3'）：CAGTCGAGGAAGACACTGGA

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Spass19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，分別運(yùn)用t-test和ANOVA檢測(cè)方法對(duì)NFκB p65和FGF23、Orai1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以means±SEM表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGF-β對(duì)NFκB p65轉(zhuǎn)錄水平的影響

如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，經(jīng)20 ng·mL-1TGF-β刺激UMR106細(xì)胞的 NFκB p65的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。

圖1 TGF-β對(duì)NFκB p65轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.1 Effect of TGF-β on NFκB p65 transcript levels注：*，TGF-β處理組與正常對(duì)照組差異顯著

2.2 TGF-β對(duì)Orai1轉(zhuǎn)錄水平的影響

如圖2、圖3所示，與正常對(duì)照組相比，在20ng·mL-1TGF-β刺激下，UMR106細(xì)胞Orai1的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。分別添加Orai1抑制劑YM58483（圖2）和NFκB 的抑制劑 Wogonin（圖 3）后，TGF-β 刺激組的Orai1轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低。此外，分別添加的抑制劑YM58483和Wogonin與正常對(duì)照組相比，Orai1轉(zhuǎn)錄水平也顯著降低。

圖2 添加Orai1抑制劑YM58483，TGF-β對(duì)Orai1轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.2 Effect of TGF-β on Orai1 transcript levels in the absence or presence of YM58483注：*，TGF-β處理組與正常對(duì)照組差異顯著#，添加YM 8483組與未添加組間差異顯著

圖3 添加NFκB抑制劑Wogonin，TGF-β對(duì)Orai1轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.3 Effect of TGF-β on Orai1 transcript levels in the absence or presence of wogonin注：*，正常對(duì)照組與TGF-β處理組差異顯著#，添加Wogonin組與未添加組間差異顯著

2.3 TGF-β對(duì)FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響

如圖4、圖5所示，與正常對(duì)照組相比，在20 ng·mL-1TGF-β刺激下UMR106細(xì)胞FGF23的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，并且分別添加Orai1抑制劑YM58483（圖4）和 NFκB的抑制劑 Wogonin（圖 5）后，TGF-β 刺激組的FGF23的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。

圖4 添加Orai1抑制劑YM58483，TGF-β對(duì)FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effect of TGF-β on FGF23 transcript levels in the absence or presence of YM58483注：*，TGF-β處理組與正常對(duì)照組差異顯著#，添加YM 8483組與未添加組間差異顯著

圖5 添加NFκB抑制劑Wogonin，TGF-β對(duì)FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effect of TGF-β on FGF23 transcript levels in the absence or presence of wogonin注：*，正常對(duì)照組與TGF-β處理組差異顯著#，添加Wogonin組與未添加組間差異顯著

3 討論

FGF23是由骨組織中的成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生的內(nèi)分泌因子，主要作用于腎組織，通過(guò)抑制腎1α羥化酶和尿磷重吸收等來(lái)調(diào)節(jié)1，25（OH）2D3的形成與活性，以及鈣磷代謝等生理作用。在慢性腎病與心損傷疾病中，F(xiàn)GF23的水平顯著升高，并且與這些病的預(yù)后不良有著直接關(guān)系[12-13]。因此，探究FGF23的生理病理機(jī)制對(duì)疾病的防治至關(guān)重要。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究，F(xiàn)GF23的釋放是由SOCE引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高來(lái)調(diào)節(jié)的。膜蛋白O－rai1組成了鈣釋放激活鈣通道（CRAC）的離子通道，與其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的感受器STIM1相互作用，完成細(xì)胞鈣池內(nèi)鈣離子的釋放與進(jìn)入，且Orai1在UMR106細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量相對(duì)較高，而轉(zhuǎn)錄因子 NFκB則是調(diào)節(jié)Orai1的主要信號(hào)，進(jìn)而影響FGF23的釋放[7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β可上調(diào)NFκB水平進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[10，14]。實(shí)驗(yàn)利用熒光定量RT-PCR技術(shù)，首先驗(yàn)證了TGF-β上調(diào)UMR106細(xì)胞的NFκB水平，通過(guò)分別添加 Orai1抑制劑YM58483和NFκB的抑制劑Wogonin，分析TGF-β對(duì)Orai1和FGF23轉(zhuǎn)錄水平的影響，最終確證了TGF-β通過(guò)介導(dǎo)NFκB上調(diào)Orai1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而調(diào)控FGF23釋放這一新的信號(hào)通路。Orai1不僅是調(diào)控SOCE過(guò)程中Ca2+進(jìn)入，而且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖遷移等作用，TGF-β作為NFκB的激活劑，可能通過(guò)NFκB激活Orai1信號(hào)通路啟動(dòng)成骨細(xì)胞的增殖，分化等促進(jìn)FGF23的釋放，從而在腎臟中發(fā)揮生理病理作用，隨著血清中FGF23含量的顯著升高加劇慢性腎病的病程發(fā)展，因此降低成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子的上述信號(hào)通路可調(diào)控FGF23的形成，為進(jìn)一步治療慢性腎病等疾病提供有利證據(jù)。

4 結(jié)論

TGF-β可通過(guò)NFκB依賴的上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+進(jìn)入的調(diào)控膜蛋白Orai1調(diào)控FGF23在成骨細(xì)胞中的分泌，為進(jìn)一步探究FGF23在慢性腎臟疾病中病理作用提供有力的研究基礎(chǔ)。

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TGF-β-sensitive Store-operated Ca2+Entry in the Regulation of FGF23 Release

Zhang Bingbing1，Yang Wei2，Xu Chuang2，Xia Cheng2，Zhang Hongyou2，Wang Chunren1，2，Yu Liyun1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

To study whether the effect of TGF-β on FGF23 mRNA expression was involved and required Ca2+entry，F(xiàn)GF23 and Orai1 mRNA were measured by real-time RT-PCR in UMR106 cells.The results showed that FGF23 mRNA expression was significantly enhanced by TGF-β treat in UMR106；conversely，an effect was abolished by Orai1 inhibitor YM58483 and NF-κB inhibitor Wogonin.Moreover，Orai1 transcript levels were significantly up-regulated by TGF-β，an effect attenuated by wogonin.It indicated TGF-β up-regulates FGF23 was released by NF-κB dependent up-regulation of Orai1 transcription，which may give strategies for new therapeutic options.

TGF-β；FGF23；store-operated Ca2+entry

Q25

A

1002-2090（2017）05-0066-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.016

2017-03-06

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31502133）；黑龍江省科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C2015043）。

張冰冰（1984-），女，講師，德國(guó)圖賓根大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事遺傳與基因工程方面的教學(xué)與研究。

余麗蕓，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：yuliyun1227@126.com。