原冬偉，劉秋瑾，劉宏睿，王曉雅，張佳韌，范文祿

α-SMA與TGF-β1在大鼠肝纖維化中的表達(dá)及相互關(guān)系

原冬偉，劉秋瑾，劉宏睿，王曉雅，張佳韌，范文祿

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

為明確α-SMA和TGF-β1在肝臟纖維化過程中的作用和相互關(guān)系，研究首先利用CCl4腹腔注射的方法建立肝臟纖維化大鼠模型，通過組織學(xué)、免疫組織化學(xué)及蛋白組學(xué)方法檢測肝臟纖維化過程中病理組織結(jié)構(gòu)變化、α-SMA和TGF-β1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示肝臟纖維化模型造模成功，肝臟組織呈現(xiàn)明顯纖維化病變特征，α-SMA和TGF-β1的表達(dá)呈陽性，且與肝臟纖維化程度呈正相關(guān)。α-SMA和TGF-β1是肝臟纖維化過程中的重要細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)肝臟纖維化的形成，并可能協(xié)同參與。

肝臟纖維化；CCl4；α-SMA；TGF-β1；大鼠

肝臟纖維化是以肝臟損傷后細(xì)胞外基質(zhì)沉淀為特征，是肝實質(zhì)細(xì)胞被進(jìn)展性增生細(xì)胞外基質(zhì)所替代的過程，最終導(dǎo)致肝臟小葉結(jié)構(gòu)改變及血管紊亂[1,2]。肝臟纖維化發(fā)生過程中沉積細(xì)胞外基質(zhì)可來源于不同類型的細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell，HSC）是肝臟纖維化過程中最關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞[3]。HSC在多種細(xì)胞因子的作用下被激活，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為具有促纖維化、增生、趨化等功能的肌成纖維樣細(xì)胞[4]。細(xì)胞因子的作用可以影響肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，特別是與HSC活化相關(guān)的α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）和促纖維化效應(yīng)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）。α-SMA是HSC活化的標(biāo)志，HSC活化產(chǎn)生的TGF-β1是最重要的致纖維化因子[5]。通檢測大鼠肝臟纖維化模型中α-SMA和TGF-β1的表達(dá)情況，闡明二者在纖維化過程中的作用和相互關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

無水乙醇、二甲苯、40%甲醛溶液、CCl4均購自哈爾濱賽特生物技術(shù)有限公司。愛德士生化分析儀專用試劑片、HE染色試劑盒均購自哈爾濱佰杰斯生物科技公司。濃縮型SABC-DyLight 488（大鼠IgG）試劑盒、DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程有限公司。TGF-β1、α-SMA抗體購自Sigma公司。橄欖油為市售。梅特勒電子天平（ME1002TE），徠卡自動載玻片染色機(jī)（Leica ST5010）購自黑龍江省海金蘭科技發(fā)展有限公司；生物組織脫水機(jī)（KD-TS3A），生物組織冷凍包埋機(jī)（KD-BM、BL），轉(zhuǎn)輪式石蠟切片機(jī)（KD-2258），生物組織攤烤片機(jī)（KD-T），購自浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；愛德士生化分析儀（IDXX VetTest8008），購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；麥克奧迪光學(xué)顯微鏡（BA310）及成像系統(tǒng)，購自北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司。

1.2 肝纖維化模型制備

清潔級雄性SD大鼠20只，體重200～220 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分成2組：對照組和模型組。模型組大鼠腹腔注射 40%CCl4橄欖油溶液 3 mL·kg-1，3 次·wk-1[6]，造模8周，基礎(chǔ)飼料飼喂，礦物水飲水。對照組同模型組等劑量腹腔注射生理鹽水，基礎(chǔ)飼料飼喂，自來水飲水。實驗期間觀察各組大鼠一般情況，包括精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度、食量、存活率等。在造模第4、8周分別取各組大鼠各5只，乙醚麻醉后打開腹腔下腔靜脈采全血分離血清，同時觀察肝臟外觀變化并摘取部分肝臟組織置于10%甲醛溶液固定，部分肝臟組織-70℃凍存。實驗過程中死亡大鼠同樣進(jìn)行剖檢取材。

1.3 肝臟功能指標(biāo)檢測

全血分離血清后送檢黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物醫(yī)院化驗室，檢測指標(biāo)包括：反映肝臟細(xì)胞蛋白合成代謝的總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）；反映肝臟細(xì)胞受損的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、伽馬谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶（GGT）。

1.4 病理組織學(xué)觀察及蛋白免疫印跡檢測

按照常規(guī)方法制備高質(zhì)量肝臟組織切片[7]。蘇木素-伊紅（H.E.）和AZAN染色顯微鏡觀察肝小葉結(jié)構(gòu)變化及纖維化程度判定。SABC免疫組織化學(xué)法和Western-blot法檢測肝臟組織中α-SMA和TGF-β1的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，試驗結(jié)果數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 大體觀察

對照組大鼠毛發(fā)光澤，活潑好動，食欲正常，體重增加，對外界反應(yīng)敏感。模型組大鼠毛發(fā)疏松無光澤，精神不振，不愿走動，食欲差，體重增長緩慢。各組大鼠體重變化情況見表1。實驗期間模型組大鼠在第7周、第8周各死亡1只。

表1 實驗組大鼠體重變化情況（g）Table 1 Changes of body weight of rats in experimental group（g）

2.2 肝功指標(biāo)監(jiān)測

模型組大鼠血清中ALT、AST指標(biāo)在第4周、第8周與對照組比較明顯升高，呈極顯著性差異（P＜0.01）。模型組大鼠血清中GGT指標(biāo)也明顯升高，與對照組比較呈顯著性差異（P＜0.05）。模型組大鼠血清中ALB、TP與對照組比較指標(biāo)降低，與同期對照組比較呈顯著性差異（P＜0.05）。數(shù)據(jù)詳見表2，表3，所有數(shù)據(jù)表明模型組大鼠肝臟明顯受損。

表2 實驗組大鼠4周血清肝功指標(biāo)Table 2 Liver function of experimental rats at 4 weeks

表3 實驗組大鼠8周血清肝功指標(biāo)Table 3 Liver function of experimental rats at 8 weeks

2.3 病理組織學(xué)觀察及蛋白免疫印跡檢測

對照組大鼠肝臟組織未見明顯結(jié)構(gòu)改變，模型組大鼠肝臟的病理學(xué)改變大致分為：炎癥反應(yīng)、間質(zhì)細(xì)胞增生及彌漫性纖維化。H.E.染色結(jié)果顯示，對照組肝臟組織肝臟細(xì)胞大小正常，小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核圓，胞質(zhì)豐富。模型組4周時肝臟組織肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞脂肪變性，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，小葉間纖維結(jié)締輕度增生（圖1）；8周時肝臟細(xì)胞脂肪變性變輕，可見肝細(xì)胞壞死，小葉內(nèi)可見成纖維樣細(xì)胞，匯管區(qū)和小葉間纖維結(jié)締組織增生，少量炎性細(xì)胞浸潤（圖1）。AZAN染色結(jié)果顯示，對照組肝臟組織無膠原纖維異常沉積現(xiàn)象。模型組4周和8周時在小葉周邊、門脈區(qū)、小葉內(nèi)均可見膠原纖維沉積現(xiàn)象（圖1）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，α-SMA在大鼠肝臟中表達(dá)在小葉周、門脈區(qū)及增生的纖維組織，且隨造模時間延長表達(dá)量逐漸增加；TGF-β1在大鼠肝臟中表達(dá)在肝竇狀隙邊緣肝枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞的胞漿中，表達(dá)水平也隨時間延長逐漸增加（圖2）。蛋白組學(xué)結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，α-SMA和TGF-β1蛋白表達(dá)量在模型組大鼠肝臟組織中逐漸升高，且二者也呈現(xiàn)正相關(guān)情況（圖3）。

圖1 大鼠肝臟病理組織學(xué)觀察Fig.1 Histopathological observation of rat liver

圖2 α-SMA和TGF-β1在大鼠肝臟組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of α-SMA and TGF- β1 in rat liver tissue

圖3 α-SMA和TGF-β1蛋白在大鼠肝臟組織中的表達(dá)Fig.3 Expression ofα-SMA and TGF- β1 protein in rat liver tissue in vivo

3 討論

肝纖維化是許多肝臟慢性疾病共有的病理改變，是各種原因引起肝臟損傷后的疤痕修復(fù)反應(yīng)，其表現(xiàn)為肝功能下降，肝內(nèi)廣泛纖維組織增生和細(xì)胞外基質(zhì)的重塑[8，9]。目前肝纖維化造模方法很多而且發(fā)展成熟，主要被應(yīng)用在研究其發(fā)病機(jī)制和篩選有效治療藥物等方面。CCl4經(jīng)腹腔注射法制備大鼠肝纖維化動物模型是一種經(jīng)典的動物模型制備方法[6]，以其制模方便、時間短、成模率高的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在臨床和實驗研究上。研究參考已有文獻(xiàn)報道造模方法，以低劑量CCl4腹腔注射，經(jīng)門靜脈系統(tǒng)吸收入血引起肝纖維化形成。實驗結(jié)果顯示肝纖維化動物模型造模成功，大鼠肝臟發(fā)生肝細(xì)胞的變性、壞死，小葉間和門脈區(qū)結(jié)締組織增生，造模8周形成明顯的假小葉結(jié)構(gòu)，大量膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)形成，ALT、AST等肝功指標(biāo)的明顯變化。

肝纖維化形成與多種細(xì)胞和細(xì)胞因子的動態(tài)改變密切相關(guān)，影響肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，調(diào)控著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[10]。HSC是肝臟纖維化過程中最關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，主要分布于Disse間隙內(nèi)，包繞在肝竇周圍，而多種細(xì)胞因子可調(diào)控HSC的活化，是調(diào)控肝纖維化的主要手段[11]。HSC在多種細(xì)胞因子的作用下被激活，可分泌TGF-β1等細(xì)胞因子，通過自分泌進(jìn)一步維持自身的活化狀態(tài)并激活臨近HSC，活化的HSC增殖，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為具有促纖維化、增生、趨化等功能的成纖維樣細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞[12]。α-SMA是活化的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。TGF-β1是肝纖維化形成過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，TGF-β1信號通路的激活能促進(jìn)肝損傷、炎癥因子的產(chǎn)生及HSC的活化，也可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡和抑制肝細(xì)胞增生促進(jìn)肝纖維化的產(chǎn)生[13]。所以近年來TGF-β1及其Smad信號通路和α-SMA等成為纖維化疾病研究的熱點(diǎn)，該信號通路在肝臟纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。研究通過實驗證實在肝臟纖維化過程中α-SMA和TGF-β1表達(dá)，并伴隨纖維化程度的加重而表達(dá)逐漸增多，說明α-SMA和TGF-β1與肝臟纖維化的形成密切相關(guān)。α-SMA和TGF-β1表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性也可說明TGF-β1的分泌能夠活化HSC，刺激成纖維樣細(xì)胞的增殖，加強(qiáng)α-SMA的表達(dá)。

總之，α-SMA和TGF-β1是肝臟纖維化形成過程中重要細(xì)胞因子，并可能協(xié)同參與肝臟纖維化的形成，因此抑制α-SMA和TGF-β1的表達(dá)或阻斷相應(yīng)細(xì)胞信號通路都將為臨床肝臟纖維化治療提供理論依據(jù)。

［1］ 盧瑋，劉學(xué)恩，莊輝.肝纖維化相關(guān)細(xì)胞因子和信號通路研究進(jìn)展［J］.中國病毒病雜志，2016（5）：385-390.

［2］ Hernandez-Gea V，F(xiàn)riedman SL.Pathogenesis of liver fibrosis［J］.Ann Rev PatholMech Dis，2011（6）：425-456.

［3］ Mederacke I，Hsu CC，Troger JS，et al.Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology ［J］.Nat Commun，2013（6）：2823.

［4］ Forbes SJ，Parola M.Liver fibrogenie cells ［J］.Best Pract Res ClinGastroenterol，2011，25（2）：207-217.

［5］ 武希潤，呂敏和，王琦，等.α平滑肌肌動蛋白表達(dá)及血漿轉(zhuǎn)化生長因子β1變化在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用［J］.中華肝臟病雜志，2004，12（7）：400-402.

［6］ 張云巍，胡亞卓，徐麗娟，等.四氯化碳法制備肝硬化大鼠模型中重要臟器的病理改變［J］.世界華人消化雜志，2014，22（1）：74-79.

［7］ 李鈺，劉佳，韋丹丹，等.動物病理組織切片制作方法改良的探討［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（15）：154-157.

［8］ 肖穎，楊濤濤，周衛(wèi)民，等.TGF-β/Smad與 Wnt/β-catenin在博萊霉素致大鼠肺纖維中的表達(dá)及相互作用［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（2）：63-69.

［9］ 曾志萍，郭津生.肝纖維化發(fā)生機(jī)制及治療進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2017，25（7）：569-575.

［10］ 黃艷，黃成，李俊.肝纖維化過程中Kupffer細(xì)胞分泌細(xì)胞因子對肝星狀細(xì)胞活化增殖、凋亡的調(diào)控［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26（1）：9-13.

［11］ Duval F，Moreno-Cuevas JE，Gonzalez-Garza MT，et al.Liverfibrosisand protection mechanismsaction of medicinal plants targeting apoptosis of hepatocytes and hepatic stellate cells ［J］.AdvPharmacolSci，2014（7）：373295.

［12］ 武淑琴，吳丹丹，王新，等.不同劑量對乙酰氨基酚誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2015，27（3）：40-43.

［13］ Tu X，Zhang H，Zhang J，et al.MicroRA-101 suppresses liver fibrosis by targeting the TGF-β signalling pathway［J］.J Pathol，2014，234（1）：46-59.

Expression and Relationship between α-SMA and TGF-β1 in Rat Liver Fibrosis Model

Yuan Dongwei，Liu Qiujin，Liu Hongrui，Wang Xiaoya，Zhang Jiaren，F(xiàn)an Wenlu
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To make clear the effect and relationship between α-SMA and TGF-β1 in liver fibrosis，intraperitoneal injection of CCl4was usedto make liver fibrosis model in rats，and then histopathological changes were detectedand α-SMA and TGF-β1were expressedby histopathological method，immunohistochemistry and proteomics method in the process of liver fibrosis.The results showed that the model was successfully built and pathological characteristics were obviously observed.The expression of α-SMA and TGF-β1 was positive and showedpositively correlated with liver fibrosis process.α-SMA and TGF-β1 were important cytokines which could promote the liver fibrosis process，and mightcooperate in formation of liver fibrosis.

liver fibrosis；CCl4；α-SMA；TGF-β1；rat

S852.34

A

1002-2090（2017）05-0033-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.009

2017-04-13

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（xc2014020）。

原冬偉（1980-），男，講師，韓國國立慶北大學(xué)獸醫(yī)科大學(xué)，現(xiàn)主要從事動物疾病病理機(jī)制及診斷方面的研究工作。