王麗坤 ，張瑩 ，崔宇超 ，高俊峰 ，2，侯美如 ，楊淑萍

丹頂鶴體內(nèi)曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)的鑒定

王麗坤1，張瑩1，崔宇超1，高俊峰1，2，侯美如1，楊淑萍1

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161000；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

為了鑒定經(jīng)吡喹酮治療有拉稀癥狀的丹頂鶴排出的吸蟲(chóng)種類(lèi)，應(yīng)用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)該吸蟲(chóng)進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定。結(jié)果顯示：該蟲(chóng)體形態(tài)與文獻(xiàn)中報(bào)道的曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)的形態(tài)一致；所分離的吸蟲(chóng)ITS rDNA序列全長(zhǎng)為1 083 bp，通過(guò)與NCBI上其他棘口科吸蟲(chóng)的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，表明該蟲(chóng)體與Echinostoma trivolvis的同源性可高達(dá)93%，屬于棘口屬吸蟲(chóng)，得出蟲(chóng)體鑒定結(jié)果為曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)，為魚(yú)媒介寄生蟲(chóng)的防治提供參考依據(jù)。

丹頂鶴；形態(tài)學(xué)；ITS序列；曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)

以淡水魚(yú)為媒介的禽類(lèi)寄生蟲(chóng)疾病多見(jiàn)于吸蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)病。禽類(lèi)因食入感染吸蟲(chóng)囊蚴的淡水魚(yú)蝦而感染，特別是以采食淡水魚(yú)為食的水禽，感染更為普遍。扎龍自然保護(hù)區(qū)內(nèi)存在大量的野生水禽，其中丹頂鶴是國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，丹頂鶴的生命健康關(guān)系到珍惜物種的延續(xù)和生態(tài)平衡，因此需要重點(diǎn)保護(hù)。在我國(guó)陳浩等曾經(jīng)報(bào)道在江蘇省鹽城市國(guó)家級(jí)珍禽自然保護(hù)區(qū)的丹頂鶴感染東方次睪吸蟲(chóng)[1]，梁金華等曾經(jīng)報(bào)道在廣東省肇慶市星湖濕地公園的丹頂鶴感染卷棘口吸蟲(chóng)[2]，雖然有關(guān)于黑龍江淡水魚(yú)感染多種吸蟲(chóng)的報(bào)道[3]，但黑龍江省扎龍自然保護(hù)區(qū)丹頂鶴還沒(méi)有吸蟲(chóng)感染的相關(guān)報(bào)道。因此，研究將對(duì)黑龍江省扎龍自然保護(hù)區(qū)的丹頂鶴感染吸蟲(chóng)疾病進(jìn)行檢測(cè)分析，為該自然保護(hù)區(qū)寄生蟲(chóng)疾病防控提供參考依據(jù)，也為保護(hù)珍禽丹頂鶴的健康生長(zhǎng)和有序繁殖提供保障。

目前，魚(yú)媒介寄生蟲(chóng)對(duì)水禽危害嚴(yán)重，然而禽類(lèi)的魚(yú)源性吸蟲(chóng)疾病還未引起足夠的重視。鑒于此，試驗(yàn)以丹頂鶴體內(nèi)排出的寄生蟲(chóng)為研究對(duì)象，觀察其主要形態(tài)學(xué)特征，并采取PCR進(jìn)行蟲(chóng)體分子生物學(xué)鑒定，為魚(yú)媒介寄生蟲(chóng)的防治提供參考依據(jù)，也為魚(yú)媒介感染禽類(lèi)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒別奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體

蟲(chóng)體是在黑龍江省齊齊哈爾市扎龍自然保護(hù)區(qū)丹頂鶴糞樣中所采集（圖1）。用生理鹽水將蟲(chóng)體沖洗干凈，再將蟲(chóng)體放入盛有70%酒精溶液的容器中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)成蟲(chóng)Fig.1 The adults of Echinoparyphium recurvatum

1.2 主要試劑

德氏蘇木素染液，酒精，酸酒精，二甲苯，加拿大樹(shù)膠。PMD18-T載體。Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、dNTPs、限制性內(nèi)切酶；組織 DNA 提取試劑盒（OMEGA公司）；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒（康寧生命科學(xué)吳江有限公司）。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

研究利用蘇木素染色法[3]對(duì)該蟲(chóng)體進(jìn)行染色制作吸蟲(chóng)壓片，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定。具體操作方法如下：

（1）將保存于乙醇溶液中的蟲(chóng)體取出后用流水沖洗。

（2）將蒸餾水加入德氏蘇木素染液稀釋10～15倍，使蘇木素稀釋液呈濃葡萄酒色。將保存于乙醇溶液中的蟲(chóng)體取出放在蘇木素稀釋液內(nèi)，染色過(guò)夜。

（3）將染液后的蟲(chóng)體取出，放入蒸餾水中洗掉多余的染液，然后依次通過(guò)30%、50%和70%酒精各0.5～1 h。

（4）將蟲(chóng)體移入酸酒精中褪色，待蟲(chóng)體變成淡紅色。

（5）將蟲(chóng)體置于80%酒精中，再依次通過(guò)90%和95%、100%酒精中各0.5～1 h。

（6）再將蟲(chóng)體由100%酒精中移入二甲苯中，透明 0.5～1 h。

（7）再將透明的蟲(chóng)體置于載玻片上，滴加加拿大樹(shù)膠一滴，加載蓋玻片封固，待干燥，即成，顯微鏡下觀察。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 DNA的提取

從采集的成蟲(chóng)中選取5條蟲(chóng)體樣品，用蒸餾水沖洗干凈后用研缽碾碎分別置于無(wú)菌離心管中。參照OMEGA公司提供的E.Z.N.A.TM Stool DNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取蟲(chóng)體DNA。

1.4.2 ITS序列的擴(kuò)增及序列分析

棘口吸蟲(chóng)基因組DNA ITS序列的PCR擴(kuò)增[4]，擴(kuò)增引物NC5/NC2： 上游引物 NC5：5’-GTA GGT GAA CCT GCG GAA GGA TCA TT-3’， 下游引物NC2：5’-TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT-3’。反應(yīng)采取25 μL體系，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min；進(jìn)入循環(huán)：94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。用DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）回收和純化DNA。將樣品送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，分別從正反鏈雙向進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序拼接結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的其他吸蟲(chóng)ITS序列進(jìn)行同源性進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)蘇木素染色法染色的成蟲(chóng)蟲(chóng)體小而軟薄，呈長(zhǎng)葉形。頭領(lǐng)發(fā)達(dá)，其上有45枚頭棘，頭棘前后兩排相互排列，前排較小，后排較大。背棘前后排成兩排，左右腹角棘各5枚，上列3枚，下列2枚（圖2）?？谖P(pán)位于體前端的亞腹面（圖3），腹吸盤(pán)發(fā)達(dá)，位于蟲(chóng)體前部1/4處。睪丸2個(gè)，位于蟲(chóng)體后1/2處，呈長(zhǎng)葉形或邊緣有缺刻，前后排列，卵巢發(fā)達(dá)，近似圓形，卵黃腺自腹吸盤(pán)與卵巢之間開(kāi)始分布，至蟲(chóng)體中央?yún)R合伸至體末端。子宮不發(fā)達(dá)，內(nèi)含少數(shù)蟲(chóng)卵。根據(jù)此蟲(chóng)體的形態(tài)特征，其與文獻(xiàn)中報(bào)道的曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)的形態(tài)極為相似，因此在形態(tài)學(xué)上鑒定此蟲(chóng)體為曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)。

研究利用通用引物擴(kuò)增5條成蟲(chóng)的rDNA ITS序列，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增的條帶均出現(xiàn)在約1 000 bp的位置，與預(yù)期目的片段一致（圖4），且無(wú)非特異性條帶。經(jīng)測(cè)序5條蟲(chóng)體的ITS序列完全一致，序列全長(zhǎng)為1 083 bp。將擴(kuò)增的ITS序列與NCBI上其他吸蟲(chóng)的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明該蟲(chóng)體與曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)（Echinoparyphium recurvatum）的同源性可高達(dá)99.3%，因此在分子水平上也確定研究的吸蟲(chóng)為曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)。

圖2 曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)45枚頭棘如箭頭所示Fig.2 The spines of Echinoparyphium recurvatum

圖3 曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)腹吸盤(pán)Fig.3 The ventral sucker of Echinoparyphium recurvatum

圖4 ITS序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 ITS sequence PCR amplification

3 討論

形態(tài)學(xué)鑒定是傳統(tǒng)的鑒定吸蟲(chóng)分類(lèi)的方法，吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的鑒定主要通過(guò)觀察吸蟲(chóng)的大小形態(tài)、口腹吸盤(pán)的大小以及相對(duì)位置，口吸盤(pán)是否有棘，卵巢、子宮以及睪丸等形狀和相對(duì)位置大小等。吸蟲(chóng)蟲(chóng)體形態(tài)特征不易直接觀察，通過(guò)制作裝片可以很清晰的觀察蟲(chóng)體內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，可以有效的區(qū)別鑒定吸蟲(chóng)的種類(lèi)。形態(tài)學(xué)鑒定是吸蟲(chóng)鑒定最直接常用的方法，但是由于蟲(chóng)體的形態(tài)特征易受環(huán)境、宿主等因素影響，使得形態(tài)學(xué)分類(lèi)的準(zhǔn)確性和可靠性受到一定的限制[5-7]，例如一些同名異物的吸蟲(chóng)[9]。相比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)具有效率高、樣品用量少、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。因此，分子生物學(xué)鑒定避免了應(yīng)用形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類(lèi)而引起的紛爭(zhēng)，完善了傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上的一些不足。目前，遺傳標(biāo)記基因rDNA ITS因其在種內(nèi)變異很小，并且在種間差異很明顯，已被廣泛應(yīng)用于物種的分類(lèi)學(xué)研究。ITS序列在吸蟲(chóng)鑒定工作中占有重要作用，ITS序列在研究屬內(nèi)和關(guān)系較近的屬間關(guān)系時(shí)是十分有價(jià)值的，尤其在近似種的區(qū)別中。近年來(lái)，ITS序列分析已廣泛應(yīng)用于吸蟲(chóng)科、亞科、族、屬和種間系統(tǒng)學(xué)研究[8-9]。因此，研究采用了分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合的方法確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

研究通過(guò)對(duì)驅(qū)蟲(chóng)所得的棘口科吸蟲(chóng)成蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，確定了本區(qū)域魚(yú)媒介感染丹頂鶴的寄生蟲(chóng)種類(lèi)為曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)。曲領(lǐng)棘緣吸蟲(chóng)的第二中間宿主為淡水魚(yú)類(lèi)，禽類(lèi)因啄食第二中間宿主而感染其囊蚴，囊蚴在小腸內(nèi)脫囊，逸出的幼蟲(chóng)在小腸內(nèi)約7～9 d即可發(fā)育成熟、產(chǎn)卵。其成蟲(chóng)多在小腸上段寄生，蟲(chóng)體頭部插入腸粘膜，引發(fā)腸道局部炎癥病變，導(dǎo)致丹頂鶴食欲降低，生長(zhǎng)遲緩等癥狀，給丹頂鶴的健康生長(zhǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的影響，感染率高時(shí)還可造成鶴只全身衰竭甚至死亡。所以，研究的確切診斷，是有效治愈丹頂鶴吸蟲(chóng)疾病的關(guān)鍵所在，是保證丹頂鶴健康生長(zhǎng)和有序繁殖的重要因素，并為有針對(duì)性的防控魚(yú)媒介感染禽類(lèi)寄生蟲(chóng)提供了有效的參考依據(jù)。研究的蟲(chóng)種鑒定更為棘口科吸蟲(chóng)基因庫(kù)增添了新的數(shù)據(jù)，為今后寄生蟲(chóng)領(lǐng)域更深入的研究奠定了有利基礎(chǔ)。

［1］ 高志東，蔡中濤，陳浩，等.丹頂鶴東方次睪吸蟲(chóng)病的發(fā)現(xiàn)及治療［M］.北京：中國(guó)家禽，2004.

［2］ 梁金華，冼永杰，蘭偉強(qiáng).丹頂鶴全群驅(qū)蟲(chóng)效果分析［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2014，39（173）：21-22.

［3］ 段紅，高俊峰，劉澤軒，等.四種三齒線蟲(chóng)核糖體ITS序列的比較分析及親緣關(guān)系探討［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（4）：54-57.

［4］ 王運(yùn)宏，薄新文，孫延鳴，等.絳蟲(chóng)成蟲(chóng)制片方法的改進(jìn)［J］.中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)病，2007，15（6）：17-20.

［5］ 牛慶麗，羅建勛，殷宏.轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）在寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)分類(lèi)中的應(yīng)用及其進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)病，2008（1）：41-47.

［6］ 劉娟，李雍龍.DNA序列分析在吸蟲(chóng)種株基因差異研究方面的應(yīng)用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)病分冊(cè)，2004，31（3）：108-111.

［7］ Kinsella J M.Growth，development，and intraspecific variation of Quinqueserialis quinqueserialis（Trematoda：Notocotylidae）in rodent hosts［J］.J Parasitol，1971，57（1）：62-70.

［8］ 楊健美，苑純秀，馮新港，等.日本血吸蟲(chóng)感染不同相容性動(dòng)物宿主的比較研究［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（12）：1207-1211.

［9］ 梁思婷，董輝，朱順海，等.喜鵲和山斑鳩體內(nèi)棘口科吸蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定［J］.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2015（4）：44-52.

［10］ 羅洪林，黃維義，許翠翠，等.分子分類(lèi)結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察鑒定重慶地區(qū)片形吸蟲(chóng)種類(lèi)［J］.中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)病，2007，15（4）：7-11.

Identification of Echinoparyphium recurvatum in Grus japonensis

Wang Likun1，Zhang Ying1，Cui Yuchao1，Gao Junfeng1,2，Hou Meiru1，Yang Shuping1
（1.Dapartment of Parasitology，Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161000；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to identification the trematode species，which were collected from Grus japonensis with diarrhea，morphology and molecular biology method were carried out.Morphological identification results showed that the morphological characteristscs were consistent with Echinoparyphium recurvatum.Molecular identification showed，the length of ITS rDNA sequence was 1 083 bp long，Comparison ITS sequence of NCBI morphological，it displayed that the highest similarity rate was 93%with Echinoparyphium recurvatum，which belongs to Echinostoma members.Therefore，the trematode isolated from Grus japonensis was identified as Echinoparyphium recurvatum.The results provided a reference for the prevention of fish-born trematode.

Grus japonensis；Morphological；ITS sequences；Echinoparyphium recurvatumi

S852.7

A

1002-2090（2017）05-0037-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.010

2017-04-05

王麗坤（1981-），女，高級(jí)獸醫(yī)師，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事動(dòng)物寄生蟲(chóng)病學(xué)方面的研究。