黃凱毅+魏丹妮+方金陽(yáng)+李晞瑗+嚴(yán)斌俊

[摘要] 該研究建立了一種基于紫外光譜的醒腦靜注射液一次提取過(guò)程分析方法，用于快速測(cè)定蒸餾提取液中異佛爾酮、4-亞甲基-異佛爾酮、莪術(shù)雙環(huán)烯酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、莪術(shù)呋喃二烯酮、莪術(shù)醇、吉馬酮9種成分含量。在醒腦靜注射液一次提取過(guò)程中收集郁金-梔子水蒸氣蒸餾液樣品166份，掃描紫外光譜，并用高效液相色譜測(cè)定9種成分含量，使用最小二乘支持向量機(jī)和徑向基人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法建立紫外光譜與各成分含量之間的多元校正模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該研究建立的紫外光譜分析方法能較準(zhǔn)確地測(cè)定蒸餾提取液中9種成分含量，預(yù)測(cè)誤差均方根分別為0.068， 0.147， 0.215， 0.319， 1.01， 1.27， 0.764， 0.147， 0.610 mg·L-1。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、低成本的優(yōu)點(diǎn)，有助于醒腦靜注射液提取過(guò)程監(jiān)測(cè)和提取終點(diǎn)判斷，減少產(chǎn)品質(zhì)量缺陷和質(zhì)量差異。

[關(guān)鍵詞] 醒腦靜注射液； 紫外光譜； 過(guò)程分析； 郁金； 梔子； 水蒸氣蒸餾； 支持向量機(jī)； 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

[Abstract] In this study， an analytical method based on ultraviolet spectroscopy was established for the rapid determination of nine components including isophorone， 4-methylene-isophorone， curcumenone， curcumenol， curdione， curzerenone， furanodienone， curcumol and germacrone in the first extraction process of Xingnaojing injection. 166 distillate samples of Gardeniae Fructus and Radix Curcumae were collected in the first extraction process of Xingnaojing injection. The ultraviolet spectra of these samples were collected， and the contents of the nine components in these samples were determined by high performance liquid chromatography. Least squares support vector machine and radial basis function artificial neural network were used to establish the multivariate calibration models between the ultraviolet spectra and the contents of the nine components. The results showed that the established ultraviolet spectrum analysis method can determine the contents of the nine components in the distillates accurately， with root mean square error of prediction of 0.068， 0.147， 0.215， 0.319， 1.01， 1.27， 0.764， 0.147， 0.610 mg·L-1， respectively. This proposed method is a rapid， simple and low-cost tool for the monitoring and endpoint determination of the extraction process of Xingnaojing injection to reduce quality defects and variations.

[Key words] Xingnaojing injection； ultraviolet spectroscopy； process analysis； Curcumae Radix； Gardeniae Fructus； hydrodistillation； least squares support vector machine； radial basis function artificial neural network

醒腦靜注射液是由麝香、郁金、梔子、冰片4味中藥制成的注射劑，具有清熱瀉火、涼血解毒、開(kāi)竅醒腦的功效，臨床上主要用于中風(fēng)、腦缺血、意識(shí)障礙、急性酒精中毒等病癥^[1-2]，是年銷(xiāo)售額超20億元的中藥大品種。該注射液生產(chǎn)中采用水蒸氣蒸餾法對(duì)藥材中揮發(fā)性成分進(jìn)行提取。首先將郁金、梔子加水進(jìn)行第一次蒸餾提取，收集蒸餾液，然后將麝香加入蒸餾液中，并加水進(jìn)行第二次蒸餾提取。以水蒸氣蒸餾法提取這些藥材中的揮發(fā)性成分具有雜質(zhì)提取量少的優(yōu)點(diǎn)，但生產(chǎn)中存在提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗高、提取物批次間質(zhì)量差異大等問(wèn)題。

目前對(duì)醒腦靜注射液的分析方法研究主要集中于成品質(zhì)量檢測(cè)^[3-5]，測(cè)定麝香酮、龍腦以及源于郁金的倍半萜類(lèi)生物活性成分^[6]，如莪術(shù)雙環(huán)烯酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮等^[4]。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液中源于梔子的2種主要成分為異佛爾酮和4-亞甲基-異佛爾酮，并建立了高效液相色譜（HPLC）分析方法用于測(cè)定一次提取過(guò)程中間體（即郁金-梔子蒸餾液）中源于梔子的這2種成分及源于郁金的7種倍半萜類(lèi)成分（莪術(shù)雙環(huán)烯酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、莪術(shù)呋喃二烯酮、莪術(shù)醇、吉馬酮）^[7]。

對(duì)于醒腦靜注射液生產(chǎn)過(guò)程分析方法目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，而為了合理判斷提取過(guò)程終點(diǎn)，提升生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量監(jiān)控水平，需要研究并建立提取過(guò)程分析方法。紫外光譜（UV）是一種快速、無(wú)損的分析方法，與近紅外光譜、拉曼光譜等相比，具有靈敏度高、儀器價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn)^[8]，已被用于多種中藥的生產(chǎn)過(guò)程分析^[8-10]。由于郁金-梔子蒸餾液中待測(cè)成分濃度較低，因此本研究選擇紫外光譜分析技術(shù)，建立蒸餾提取液中各成分含量與紫外光譜間的定量校正模型，以快速測(cè)定異佛爾酮、4-亞甲基-異佛爾酮、莪術(shù)雙環(huán)烯酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、莪術(shù)呋喃二烯酮、莪術(shù)醇、吉馬酮9種成分的含量。在建立校正模型時(shí)，對(duì)偏最小二乘（PLS）、最小二乘支持向量機(jī)（LS-SVM）和徑向基人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RBF-ANN）3種建模方法進(jìn)行比較并優(yōu)選校正模型。本研究建立的分析方法具有快速、簡(jiǎn)便、低成本的優(yōu)點(diǎn)，可用于提取過(guò)程監(jiān)測(cè)和提取終點(diǎn)判斷，以提高生產(chǎn)效率、減少產(chǎn)品質(zhì)量缺陷和質(zhì)量差異。

1 材料

梔子（產(chǎn)地浙江，批號(hào)151201）、郁金（產(chǎn)地浙江，批號(hào)160301）購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)楊波副教授鑒定為Gardenia jasminoides Ellis果實(shí)和溫郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling塊根。色譜純乙腈、甲醇購(gòu)自美國(guó)Tedia公司。色譜純磷酸購(gòu)自天津賽孚瑞科技有限公司。超純水由UPH-III-5T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）產(chǎn)生。莪術(shù)二酮對(duì)照品（批號(hào)150610）購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 水蒸氣蒸餾提取與樣品收集 郁金、梔子藥材分別粉碎、過(guò)篩至20～80目，各取30 g粉末，加蒸餾水1 500 mL，浸泡12 h，以水蒸氣蒸餾法進(jìn)行提取^[11]。待藥液沸騰，開(kāi)始計(jì)時(shí)，在第15，30 min分別在冷凝管出口處接取5 mL蒸餾液樣品，之后每隔30 min取樣5 mL，至蒸餾液總體積（包含取樣體積）為1 000 mL時(shí)停止取樣。按上述條件開(kāi)展10個(gè)正常批次提取實(shí)驗(yàn)。

為了擴(kuò)大樣品中各成分含量變化范圍，同時(shí)為了考察所建立的分析方法在異常提取條件下是否適用，開(kāi)展6個(gè)異常批次提取實(shí)驗(yàn)，對(duì)提取條件進(jìn)行的改變見(jiàn)表1。批次11藥材顆粒大小異常（10～20目），批次12藥材提取前未浸泡，批次13，14提取溶劑異常，批次15藥材投入量錯(cuò)誤，批次16加熱功率異常。共開(kāi)展16個(gè)批次實(shí)驗(yàn)，取樣166份。

2.2 高效液相色譜分析 采用本課題組建立的一測(cè)多評(píng)方法^[7]，以莪術(shù)二酮為內(nèi)參物對(duì)照品，測(cè)定樣品中9種成分含量。儀器為Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）。使用迪馬鉆石C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）。以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸-水溶液為流動(dòng)相B。梯度洗脫（0～10 min，30%～55% A；10～24 min，55% A；24～35 min，55%～70% A；35～40 min，70%～100% A）。流速0.6 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量50 μL。使用二極管陣列檢測(cè)器采集200～400 nm光譜，用于各成分定量的波長(zhǎng)為：異佛爾酮238 nm，4-亞甲基-異佛爾酮275 nm，莪術(shù)雙環(huán)烯酮256 nm，莪術(shù)烯醇261 nm，莪術(shù)二酮220 nm，莪術(shù)酮274 nm，莪術(shù)呋喃二烯酮274 nm，莪術(shù)醇210 nm，吉馬酮210 nm。

上述HPLC分析方法在方法學(xué)考察中顯示了良好的線性（線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 9）、精密度（RSD均小于1.8%）、重復(fù)性（RSD均小于2.0%）、準(zhǔn)確性（各成分加樣回收率在95.30%～105.4%），且樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定，表明該HPLC方法能準(zhǔn)確地測(cè)定9種成分含量^[7]。

2.3 紫外光譜分析 使用UV-2600紫外光譜儀（上海尤尼科儀器有限公司）測(cè)定樣品的紫外光譜。以蒸餾水為參比，波長(zhǎng)范圍為200～400 nm，波長(zhǎng)間隔1 nm，共201個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)。石英比色皿光程為2 mm，該光程能使大部分樣品的吸光度最大值在0.3～1.0，因此不需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。由于紫外光譜測(cè)定重復(fù)性很好，每個(gè)樣品只掃描一次紫外光譜。

2.4 校正模型的建立及其參數(shù)優(yōu)化 以9種成分的HPLC測(cè)定值作為參考值Y，各波長(zhǎng)下的吸光度作為自變量X，采用文獻(xiàn)[12]中SPXY算法將全部樣本劃分為訓(xùn)練集（111個(gè)樣本）和預(yù)測(cè)集（55個(gè)樣本）。分別采用PLS，LS-SVM和RBF-ANN方法對(duì)訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)建立多元校正模型，并用預(yù)測(cè)集評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)能力。建模時(shí)使用7-fold交叉驗(yàn)證，并以交叉驗(yàn)證誤差均方根（RMSECV）為指標(biāo)對(duì)各模型參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化?？疾斓墓庾V預(yù)處理方法包括無(wú)預(yù)處理、標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理（即通過(guò)預(yù)處理使各變量均值為0、標(biāo)準(zhǔn)差為1）、Savitsky-Golay平滑一階導(dǎo)和平滑二階導(dǎo)（窗口大小為7，3階多項(xiàng)式）。PLS建模使用自編的Matlab程序，并對(duì)模型中的主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化。LS-SVM建模使用LS-SVMlab 1.8工具箱^[13]，采用徑向基核函數(shù)，以單純形法對(duì)參數(shù)σ2和正則化參數(shù)γ進(jìn)行優(yōu)化。RBF-ANN建模使用Matlab自帶的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱，將擬合誤差均方根（RMSEC）的目標(biāo)設(shè)為0，隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)最大值設(shè)為30，對(duì)徑向基核函數(shù)擴(kuò)展系數(shù)（spread）進(jìn)行優(yōu)化。以擬合相關(guān)系數(shù)（Rcal）、RMSEC、交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（Rval）和RMSECV為指標(biāo)評(píng)價(jià)建模效果。以預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（Rpred）和預(yù)測(cè)誤差均方根（RMSEP）為指標(biāo)評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)能力。以樣本標(biāo)準(zhǔn)差與RMSEP的比值，即剩余預(yù)測(cè)偏差（residual predictive deviation，RPD），評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)誤差的相對(duì)大小。全部數(shù)據(jù)處理均在Matlab 7.9軟件（美國(guó)Mathworks公司）中進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品的紫外光譜 測(cè)得全部樣品的紫外光譜見(jiàn)圖1，郁金-梔子蒸餾液在200～300 nm紫外吸收較強(qiáng)，在380 nm以上吸光度趨于0。

3.2 多元校正模型的建立與評(píng)價(jià) 采用PLS，LS-SVM，RBF-ANN分別對(duì)9種成分進(jìn)行建模，當(dāng)RMSECV達(dá)到最小時(shí)，最佳的光譜預(yù)處理方法和模型參數(shù)見(jiàn)表2～4。各模型的Rcal和Rval基本都在0.9以上，且各成分濃度變化范圍遠(yuǎn)大于RMSEC和RMSECV，表明建模效果良好。此外，雖然有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)剔除異常樣本或剔除無(wú)效的光譜信息變量（即建模波段選擇）可進(jìn)一步改善建模效果，但本研究中并未發(fā)現(xiàn)明顯異常的樣本，且對(duì)紫外波段進(jìn)行初步優(yōu)選后建模效果并未得到明顯改善，所以本研究使用200～400 nm全波段進(jìn)行建模，且沒(méi)有剔除異常樣本。

根據(jù)RMSECV確定的9種成分最佳校正模型及其參數(shù)見(jiàn)表5。除了4-亞甲基-異佛爾酮和莪術(shù)雙環(huán)烯酮的最優(yōu)模型為RBF-ANN外，其余成分的最優(yōu)模型均為L(zhǎng)S-SVM。各成分的RMSEP均小于RMSECV，表明模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，未出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象。除吉馬酮以外，其他成分的Rpred都在0.875以上。而吉馬酮的Rpred偏低的原因在于，預(yù)測(cè)集中吉馬酮含量變化范圍相對(duì)訓(xùn)練集小了很多，雖然RMSEP只有0.610 mg·L-1，但相對(duì)該含量變化范圍顯得略大，對(duì)于訓(xùn)練集中吉馬酮的含量變化范圍，該預(yù)測(cè)誤差已足夠小。另外，由表5可見(jiàn)，除莪術(shù)呋喃二烯酮的RPD略小于3以外，其余8個(gè)成分的RPD均大于3，表明模型的預(yù)測(cè)誤差相對(duì)于濃度變化范圍足夠小，模型準(zhǔn)確度較好，可用于實(shí)際分析。

本研究建立的UV分析方法測(cè)定值與HPLC測(cè)定值之間的相關(guān)性，見(jiàn)圖2，圖中訓(xùn)練集樣本的縱坐標(biāo)為交叉驗(yàn)證值，預(yù)測(cè)集樣本的縱坐標(biāo)為預(yù)測(cè)值。2種分析方法間相關(guān)性良好，說(shuō)明本研究建立的方法可在一定程度上代替HPLC分析，在生產(chǎn)過(guò)程中快速測(cè)定各成分含量。

3.3 快速分析方法在提取過(guò)程中的應(yīng)用 采用本研究建立的UV快速分析方法對(duì)不同工藝條件下各成分提取情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。以批次1（正常批次）與批次11（藥材顆粒偏大批次）為例進(jìn)行了比較，見(jiàn)圖3，當(dāng)藥材顆粒偏大時(shí)，提取液中莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、莪術(shù)呋喃二烯酮、吉馬酮的含量明顯偏低，原因可能是這些成分親水性相對(duì)較弱，從藥材內(nèi)部擴(kuò)散到表面是其提取過(guò)程中的限速步驟，大顆粒藥材中這些成分?jǐn)U散相對(duì)較慢。本研究建立的分析方法能有效地區(qū)分正常和異常操作批次，可用于提取過(guò)程監(jiān)測(cè)。

4 結(jié)論

醒腦靜注射液提取過(guò)程分析方法的建立有助于解決其提取時(shí)間長(zhǎng)、提取物批次間質(zhì)量差異大等問(wèn)題。本研究基于紫外光譜建立了醒腦靜注射液一次提取過(guò)程分析方法，能快速、準(zhǔn)確地對(duì)蒸餾液中異佛爾酮、4-亞甲基-異佛爾酮、莪術(shù)雙環(huán)烯酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、莪術(shù)呋喃二烯酮、莪術(shù)醇、吉馬酮9種成分進(jìn)行含量測(cè)定。該方法與傳統(tǒng)色譜分析方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、不破壞樣品、無(wú)需樣品預(yù)處理、不消耗化學(xué)試劑、分析成本低的優(yōu)勢(shì)，可用于醒腦靜注射液的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程，有助于實(shí)現(xiàn)提取過(guò)程的可視化。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]