焦瑩+巨紅葉+胡坤霞+唐志書+宋逍

[摘要] 該文建立了熱高壓均質法制備穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的工藝方法，并對星點設計-響應面法優(yōu)化其工藝處方進行了體外制劑學評價。結果顯示按照星點設計-響應面法優(yōu)化后的最佳工藝處方制備的穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體為類球形，粒徑為（90.9±0.6） nm，多分散系數(shù)為（0.253±0.07），粒度分布均勻，Zeta電位為（-45.7±0.5） mV，包封率為（90.2±0.5）%，載藥量為（23.30±0.10）%。結果表明熱高壓均質法制備的穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體具有良好的理化性質。

[關鍵詞] 穿山龍薯蕷皂苷； 納米結構脂質載體； 制備構建； 評價

[Abstract] In this report， a heat and high-pressure homogenization method was used to prepare dioscin nanostructured lipid carriers， and the formulation of dioscin nanostructured lipid carriers was optimized by central composite design-response surface methodology. In vitro evaluation data showed that the preparation of dioscin nanostructured lipid carriers under optimal process by central composite design-response surface methodology had a spherical shape and homogeneous size distribution， with a particle size of （90.9±0.6） nm， a polydispersity index of （0.253±0.07）， Zeta potential of （-45.7±0.5） mV， encapsulation efficiency of （90.2±0.5）%， and the drug loading of （23.30±0.10）%. These results clearly indicate that the preparation of dioscin nanostructured lipid carriers made with the heat and high-pressure homogenization method have very good physical and chemical properties， suitable for therapeutic applications.

[Key words] dioscin； nanostructured lipid carrier； preparation and construction； appraise

穿山龍薯蕷皂苷（dioscin）是穿龍薯蕷Dioscorea nipponica Makino根莖穿山龍中含量較為豐富的一類甾體皂苷，它是穿山龍主要的活性成分。相關文獻報道^[1]，薯蕷皂苷具有抗腫瘤、抗血小板聚集、調節(jié)免疫、降低血脂、改善心血管功能等作用。另有研究者發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷可以抑制多種腫瘤細胞，如肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等^[2-4]。近幾年關于薯蕷皂苷劑型的研究鮮有報道，尤其是其抗肝癌的藥物劑型，故本實驗欲將薯蕷皂苷制成抗肝癌的新型納米制劑，進而能更好地發(fā)揮其抗腫瘤的作用。納米結構脂質載體（nanostructured lipid carriers，NLC）作為繼固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）之后的又一新的納米給藥系統(tǒng)，與SLN相比，NLC的載體材料中多了液體油相，它可以增加藥物的溶解度，提高藥物的包封率和載藥量、增加活性物質的穩(wěn)定性，并且NLC具有良好的靶向性，但同時也存在著不足，NLC制備過程中需要相對較高的溫度和較高的分散性^[5-11]。因此，本實驗采用熱高壓均質法結合星點設計-響應面法優(yōu)化制備穿山龍薯蕷皂苷納米制劑，以改善其溶解度和提高穿山龍薯蕷皂苷的口服生物利用度，增強其抗肝癌的靶向性，為穿山龍薯蕷皂苷新制劑的開發(fā)提供研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

BT-25S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AR1140電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；HH-2型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；78-1磁力加熱攪拌器（常州丹瑞實驗儀器設備有限公司，金壇市雙捷實驗儀器廠）；FJ200-SH數(shù)顯高速分散均質機（上海標本模型廠）；AH-BASICI 型高壓均質機（ATS Engineering Inc. ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Zetasizer Nano 3600粒度電位儀（馬爾文儀器公司）；JEM-1230透射電鏡（JEOL.日本電子光學公司）。

1.2 試劑試藥

薯蕷皂苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度96.2%，批號111707-201402）；穿山龍薯蕷皂苷提取物（南京春秋生物工程有限公司，HPLC檢測純度≥98%，批號SYZG20160413）；單硬脂酸甘油酯（GMS，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20150110）；大豆油（江西益普生藥業(yè)有限公司，批號20160602）；聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80，天津市紅巖化學試劑廠，批號20150508）；十二烷基硫酸鈉（SDS，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體和空白NLC的制備 精密稱取處方量的GMS和大豆油，水浴加熱至熔融，形成油相，加入適量的薯蕷皂苷提取物使溶解；另精密稱取處方量的吐溫80和SDS，加入一定體積的純化水，用磁力攪拌器攪拌至2種乳化劑均勻分散在水中，并加熱至與油相相同的溫度，作為水相；然后立即將水相倒入油相中，攪拌均勻，用高速分散均質機剪切成初乳液，再將初乳液趁熱倒入高壓均質機內進行高壓乳勻均質，即得到穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液。同法制備不含有薯蕷皂苷提取物的NLC，作為空白NLC溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷對照品3.00 mg，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，搖勻，超聲處理使溶解，冷卻至室溫，滴加甲醇定容至刻度，即得質量濃度為300 mg·L-1的薯蕷皂苷對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液 1 mL于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，振搖，超聲處理使其破乳，冷卻至室溫，滴加甲醇定容至刻度，搖勻，即得穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體供試品溶液。同法制備空白NLC供試品溶液。

2.2 含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 Hypersil GOLD色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（55∶45）為流動相，檢測波長為203 nm，柱溫為室溫，進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按穿山龍薯蕷皂苷峰計不超過3 000。

2.2.2 專屬性試驗 按照2.1.2項下方法制備薯蕷皂苷對照品溶液，按照2.1.3項下方法制備空白NLC溶液和穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體供試品溶液，分別用0.45 μm的有機微孔濾膜過濾，精密吸取續(xù)濾液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。空白NLC溶液對穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的檢測無干擾，表明該方法專屬性良好，見圖1。

2.2.3 線性關系考察 精密量取薯蕷皂苷對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，分別制得質量濃度為10，20，30，40，60，100，150，200，300，600 mg·L-1的一系列對照品溶液。再分別精密吸取各對照品溶液10 μL，按照2.2.1項下的色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定并記錄峰面積。以薯蕷皂苷的濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得回歸方程Y=36.501X-0.129 1，R2=0.999 1（n=3），結果表明薯蕷皂苷在10～600 mg·L-1和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.2.4 精密度考察 分別精密吸取質量濃度為20，60，110 mg·L-1的薯蕷皂苷對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件重復進樣6次，測定其峰面積，計算其日內精密度RSD為1.0%，1.1%，1.1%；分別重復進樣3 d，測定其峰面積，計算其日間精密度RSD為1.1%，1.9%，0.78%。結果表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 按最佳工藝處方制備穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體，分成若干份，放于4 ℃的環(huán)境中存放，于0，10，20，30 d分別取出1份測定其粒徑、包封率和載藥量，見表1。

根據(jù)實驗結果顯示，本實驗所制備的穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體在30 d內穩(wěn)定性良好。

2.3 包封率和載藥量的測定

本實驗采用超濾離心法^[12-14]測定穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的包封率和載藥量。精密吸取穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液 450 μL于超濾管內管（截留相對分子質量為3 000）中，將內管放入外管中，于1萬 r·min-1離心40 min，精密吸取外管中濾液10 μL，注入高效液相色譜儀中進行測定，記錄峰面積，并計算穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液中的游離藥物量W1；精密吸取穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體1 mL于10 mL量瓶中，加入適量的甲醇，振搖，超聲處理（功率250 W，頻率40 KHz）40 min，冷卻至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取續(xù)濾液10 μL注入高效液相色譜儀中，進行測定，記錄峰面積，并計算穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液的總藥量W2，按下列公式計算包封率（ER）和載藥量（DL），包封率（ER）=（W2-W1）/W2×100%，載藥量（DL）=（W2-W1）/（W載體總量+W2）×100%，其中W1為游離藥物量，W2為溶液中的總藥量，W載體總量為處方中除了藥物以外所有輔料的質量。

3 工藝處方優(yōu)選

3.1 處方篩選

本實驗將粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量作為穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的質量評價指標，分別考察了液體脂質占比、脂質總質量分數(shù)（投藥量較少，載藥量較低，未列出），復合乳化劑用量、復合乳化劑吐溫80與SDS比例及藥物量對穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量的影響，從而確定星點設計中4個影響較大的考察因素的取值范圍，為響應面法優(yōu)化提供參考依據(jù)。

3.1.1 液體脂質占比的影響 固定脂質總質量分數(shù)為6%，考察大豆油量占脂質總質量分數(shù)的0%，10%，20%，30%，40%時對穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑、Zeta電位和包封率的影響。結果見表2。

從實驗結果可以看出，當大豆油量占脂質總質量分數(shù)的20%時，粒徑相對較小，Zeta電位的絕對值較大，穩(wěn)定性相對較好，而且包封率也最高，因此本實驗將大豆油量控制在脂質總質量分數(shù)的20%。

3.1.2 脂質總質量分數(shù)的影響 固定大豆油量為脂質總質量分數(shù)的20%，考察脂質總質量分數(shù)為2%，4%，6%，8%，10%時對穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑、Zeta電位和包封率的影響，見表3。

當脂質總質量分數(shù)為4%～8%時，穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的包封率較高，粒徑較小，粒度分度相對比較均勻，Zeta電位的絕對值較大，穩(wěn)定性較好，故本實驗中選擇脂質總質量分數(shù)4%～8%為星點設計-響應面優(yōu)化中考察因素的考察范圍。

3.1.3 復合乳化劑用量的影響 本實驗選取吐溫80和SDS作為制備穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的復合乳化劑。固定脂質總質量分數(shù)為6%、液體油相占脂質總質量分數(shù)的20%，分別考察不同質量分數(shù)（0.2%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）的復合乳化劑對穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量的影響，見表4。

結果表明，隨著復合乳化劑濃度的增加，穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑、包封率和載藥量均是先增大后減小，當濃度為0.5%～1.5%時，穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑相對較小，包封率和載藥量相對較高，因此本實驗將復合乳化劑用量設為0.5%～1.5%作為星點設計-響應面優(yōu)化考察因素的取值范圍。

3.1.4 吐溫80與SDS二者比例的影響 固定脂質總質量分數(shù)為6%、液體油相占脂質總質量分數(shù)的20%，復合乳化劑用量為1%，分別考察復合乳化劑二者比例（吐溫80-SDS）為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4時對穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量的影響，見表5。

從實驗結果中得知，當復合乳化劑二者比例為2∶1～1∶1時，穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑相對較小，包封率和載藥量相對較高，因此將二者比例設為2∶1～1∶1作為星點設計-響應面法優(yōu)化中考察因素的考察范圍。

3.1.5 藥物量的影響 固定脂質總質量分數(shù)為6%、液體油相占脂質總質量分數(shù)的20%，復合乳化劑用量為1%、復合乳化劑吐溫80與SDS二者比例為2∶1，考察當投藥量為5，10，20，40，80 mg時穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量的影響，見表6。

從實驗結果可以得知，當藥物量為20，40 mg時，穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑相對較小，包封率較高，載藥量相對較好，故本實驗將藥物量控制在20～40 mg，作為星點設計-響應面法優(yōu)化考察因素的考察范圍。

3.2 工藝設計及優(yōu)化

3.2.1 工藝設計 根據(jù)單因素考察結果，本實驗選擇了對制備工藝影響較大的4個因素作為考察因素，即：藥物量（A）、脂質總質量分數(shù)（B）、復合乳化劑用量（C）、吐溫80與SDS比例（D），每個因素分別設置5個水平：0，±1，±α（α=1.682），因素與水平見表7，選取粒徑（R1）、包封率（R2）、載藥量（R3）為考察指標，通過星點設計-響應面法^[15-21]對該工藝進行優(yōu)化篩選。星點設計方案及結果見表8。

將R1，R2，R3 3個考察指標采用Hassan方法進行歸一化（0～1），通過其歸一值（OD，OD=kd1d2d3…dk，k為指標數(shù)）對其進行質量評價，并篩選出最優(yōu)工藝處方。方差分析見表9。

3.3 處方驗證試驗

依照星點設計-響應面法優(yōu)化后的工藝處方，制備3批穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體樣品，分別測定穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體的粒徑（R1）、包封率（R2）和載藥量（R3），與模型預測值比較，見表10。

該結果表明優(yōu)化后的工藝處方即可制備出重復性良好的穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體，即該處方為最佳工藝處方。

3.4 形態(tài)學考察

室溫環(huán)境下，吸取穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液適量，加純水稀釋50倍，搖勻，吸取10 μL滴至銅篩網(wǎng)上，2 min后用濾紙吸去多余的液體，滴加2.0%磷鎢酸鈉負染液，負染1.5 min后用濾紙吸去多余的負染液，自然晾干后，在透射電鏡下觀察穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液的形態(tài)并拍攝照片，見圖3。

結果顯示，穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體溶液的粒子呈類球形，大小均一，分散均勻，粒徑大約在80～110 nm。

3.5 粒徑、多分散系數(shù)（PDI）和Zeta電位的測定

按照最佳工藝處方制備穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體，平行制備3份，搖勻，吸取適量溶液置于粒度測定儀中，分別測定其粒徑、多分散系數(shù)及Zeta電位，平行測定3次，見圖4，5。

4 結語

穿山龍薯蕷皂苷屬于難溶性藥物，它具有抗炎、降血脂、保肝、抗腫瘤、抗病毒、改善心血管功能等作用，本課題前期預實驗表明穿山龍薯蕷皂苷具有良好的抗肝癌作用，故本實驗將其制成新型納米給藥系統(tǒng)——NLC，一方面可以增加它的溶解性，提高其口服生物利用度，提高藥物的包封率和載藥量，增加活性物質的穩(wěn)定性；一方面，與傳統(tǒng)的納米給藥系統(tǒng)相比，NLC具有較好的靶向性，將穿山龍薯蕷皂苷制成納米結構脂質載體，可以更好地發(fā)揮穿山龍薯蕷皂苷的抗肝癌作用。

NLC是在SLN的基礎上發(fā)展起來的一種新型納米給藥系統(tǒng)，它的不同在于，在SLN的組成中加入了與固體脂質化學性質差異較大的液體油相，液體油相與固體脂質的結合使得納米給藥系統(tǒng)產(chǎn)生晶格缺陷，從而使難溶性藥物能夠很好地存在晶格內部，進而提高難溶性藥物的包封率和載藥能力，降低活性物質在儲藏過程中的泄漏率^[22-27]。

本實驗在單因素考察中選擇復合乳化劑時，發(fā)現(xiàn)蛋黃卵磷脂、吐溫80和SDS對穿山龍薯蕷皂苷的溶解性較好，但是蛋黃卵磷脂在常溫下的吸濕性很強，對劑型的制備會有一定的影響，因此本實驗采用吐溫80和SDS作為復合乳化劑。通過單因素考察確定各個因素的取值范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件對其工藝進行星點設計-響應面優(yōu)化，結果表明最佳工藝處方制備的穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體具有較小的粒徑、較高的包封率和載藥量。NLC的穩(wěn)定性主要取決于其Zeta電位值，Zeta電位的絕對值>30 mV時，認為NLC體系是穩(wěn)定的。穿山龍薯蕷皂苷納米結構脂質載體Zeta電位的絕對值均大于30 mV，表明所制備的劑型穩(wěn)定性良好。后續(xù)本課題將對穿山龍薯蕷皂苷提取物和其納米新制劑同時進行體內研究，進一步說明將穿山龍薯蕷皂苷制成新型納米制劑可以提高其口服生物利用度，同時可以更好地靶向作用于肝癌細胞，進而確定其抗肝癌的作用，為臨床上穿山龍薯蕷皂苷抗腫瘤的研究提供基礎。

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[責任編輯 孔晶晶]