王鳳華，孔海軍，黃 玲

（1.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院運動生物化學(xué)實驗室 烏魯木齊 830054；2.濟南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心 濟南 250013）

維藥阿里紅多糖對運動性免疫抑制改善的作用機制研究＊

王鳳華1＊＊，孔海軍1，黃 玲2

（1.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院運動生物化學(xué)實驗室 烏魯木齊 830054；2.濟南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心 濟南 250013）

目的：探討維藥阿里紅多糖（FoP）的抗運動疲勞及運動免疫抑制作用，為維藥阿里紅作為天然抗氧化劑及免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。方法：通過遞增負荷跑臺運動建立長期運動疲勞及運動免疫抑制模型，不同劑量FoP作用于實驗動物，將實驗動物隨機分為陽性對照組、陰性對照組、低劑量FoP（20 mg·kg-1）+運動組、中劑量FoP（40 mg·kg-1）+運動組、高劑量FoP（80 mg·kg-1）+運動組，每周灌胃6天，共8周，灌胃期間進行遞增負荷跑臺運動。8周后處死取材，試劑盒檢測丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血紅蛋白（HB）、肌酸激酶（CK）水平，RT-PCR檢測IL-4mRNA、INF-γ mRNA相對表達量。結(jié)果：與陽性對照組比較，F(xiàn)oP可以顯著提高小鼠HB水平，F(xiàn)oP各劑量組血清CK水平出現(xiàn)顯著下降；與陽性對照組比較，F(xiàn)oP組可顯著消除MDA，F(xiàn)oP各劑量組間無顯著差異；FoP各劑量組及陰性對照組血清SOD含量顯著高于陽性對照組；FoP各劑量組IL-4 mRNA/INF-γmRNA比值基本處于平衡狀態(tài)。結(jié)論：維藥阿里紅多糖可以有效促進機體疲勞恢復(fù)，加快自由基的清除，并顯著改善機體的抗氧化能力及免疫狀態(tài)。

維藥阿里紅多糖 運動疲勞 自由基 抗氧化 運動免疫抑制

長期大強度運動可以誘發(fā)機體的免疫系統(tǒng)功能失衡，導(dǎo)致機體運動能力下降，如何有效改善運動免疫抑制現(xiàn)象已經(jīng)成為運動醫(yī)學(xué)范疇的研究熱點[1]。在運動應(yīng)激狀態(tài)下，免疫抑制因子大量增殖，可嚴(yán)重抑制淋巴細胞生成白介素(IL)-2，從而抑制T、B淋巴細胞的生成，同時，運動過程中產(chǎn)生的大量自由基可誘導(dǎo)淋巴細胞的大量凋亡。因此，通過改善機體抗氧化能力，是糾正運動免疫抑制狀態(tài)的有效途徑。近年來，中草藥及其提取物的抗免疫抑制作用受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

阿里紅（Fomes officinalisAmes，F(xiàn)oA），為擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceace）層孔菌屬（Fomes Fr.）之多年生真菌[2]。研究表明，阿里紅具有溫胃祛痰、降氣平喘、祛風(fēng)除濕和消腫利尿之功用，常用于治療慢性支氣管炎與各種癌癥[3-4]。維藥阿里紅多糖（FoP）是維藥阿里紅中的主要有效成分，可顯著提高機體的抗氧化能力，但目前國內(nèi)外鮮有將FoP應(yīng)用于運動性免疫調(diào)理的研究。

研究在運動應(yīng)激過程中，機體免疫細胞功能及增殖的特性，對于我們了解運動影響機體免疫功能這樣一個生物過程是非常重要的。機體抗氧化能力及免疫細胞增殖被視為評價免疫機能重要的指標(biāo)。鑒于此，本研究基于造成運動性免疫抑制和發(fā)展的遞增負荷運動模型，研究了FoP作用于運動疲勞及運動免疫失衡小鼠，分析補充FoP對小鼠抗氧化功能的改善，進而了解其對運動性免疫抑制改善的效果及機制，為維藥阿里紅作為天然抗氧化劑及免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

表1 引物列表

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試藥

高速冷凍離心機（Eppendorf）；酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；ZH-PT型動物實驗跑臺（淮北正華）；PCR擴增儀（德國Biometra）；水平電泳儀（北京六一）；EP凝膠成像儀（美國Alpha）；GDS8000型全自動圖像分析系統(tǒng)（美國UVP）；ABI 7300實時熒光定量PCR儀（美國ABI）；恒溫水浴鍋（北京六一）；分光光度計（德國Eppendorf）。

丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血紅蛋白（HB）、肌酸激酶（CK）測試試劑盒（南京建成生物公司）；動物組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；基因擴增引物（上海生工）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技有限公司）；FoP提取物（烏魯木齊市中醫(yī)院）。

1.1.2 實驗動物

8周齡SPF級昆明小鼠50只，雄性，體重21.6±1.9 g，（購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXX（新）2011-0003），動物統(tǒng)一使用營養(yǎng)飼料飼喂，鼠籠置于24±2℃室溫條件下，濕度50%-55%，光照12/12 h光照/黑暗。

1.2 方法

1.2.1 動物訓(xùn)練方法

小鼠在實驗室動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后進行3天的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，每天1次，每次15-30 min，待小鼠能以20 m·min-1的速度持續(xù)運動30 min，正式開始建模。本實驗采用劉曉莉、喬德才[5]等的小鼠跑臺運動模型進行訓(xùn)練，動物運動過程中，采用聲、光、電刺激鼠尾部，使其持續(xù)運動。在持續(xù)運動中，個別動物不能維持規(guī)定的運動強度時，中間可休息1-2 min，但總休息時間不能超過5 min。連續(xù)刺激或休息時間超過5 min仍不能維持原強度工作的動物，視為力竭。實驗周期為8周，動物實驗每周訓(xùn)練6天（周一至周六訓(xùn)練，周日休息），前4周每天進行1次訓(xùn)練，其余各周為每天早晚各1次；飼養(yǎng)條件相同。

1.2.2 給藥方法及分組情況

每次運動實驗后E1、E2、E3組分別人工灌胃灌注0.2 mL低劑量FoP稀釋液（20 mg·kg-1）、中劑量FoP稀釋液（40 mg·kg-1）、高劑量FoP稀釋液（80 mg·kg-1）；陽性對照組即運動后不給藥的小鼠；陰性對照組即正常飼養(yǎng)的小鼠。

1.2.3 樣本采集與測試

第8周最后一次跑臺運動后，即刻摘眼球取血，血液立即離心，取血清，低溫保存?zhèn)溆?，另保存抗凝全血備用。取小鼠血清，使用丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肌酸激酶（CK）測試試劑盒檢測上述指標(biāo)；使用血紅蛋白（HB）試劑盒檢測全血血紅蛋白。將小鼠全血0.1 mL加1 mL TRNzol，將樣品在15-30℃放置5 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，取上清，加0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。4℃12 000 rpm離心10 min，取上清，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min。4℃12 000 rpm離心10 min，取上清，使用75%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干，備用。使用30 ul ddH2O溶解沉淀，選擇GAPDH作為內(nèi)參，進行RT-PCR反應(yīng)，GAPDH、IL-4、INF-γ引物5′-3′序列見表1。使用ABI系統(tǒng)完成qRT-PCR過程，95℃30 s(1 cycle)；隨后進行40個循環(huán)，每一循環(huán)包括94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，收集熒光信號。根據(jù)相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因=ΔCt），計算IFN-γmRNA、IL-4 mRNA 的表達值。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)使用xˉ±s表示，數(shù)據(jù)分析使用SPSS22.0數(shù)據(jù)包進行顯著性差異分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著差異，通過Graph Pad 5軟件包進行圖表繪制。

2 結(jié)果

2.1 FoP對運動疲勞小鼠的抗運動疲勞作用

圖1 FoP對小鼠全血HB、血清CK水平的影響

圖2 FoP對小鼠血清MDA、SOD水平的影響

由圖1可知，經(jīng)過8周遞增負荷運動實驗，陽性對照組HB水平明顯低于陰性對照組（P＜0.05），F(xiàn)oP中高劑量組小鼠全血血紅蛋白水平顯著高于陽性對照組（P＜0.05），低劑量組HB水平高于陽性對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；與陽性對照組比較，各劑量組血清CK水平出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），同時，各劑量組血清CK水平顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。

2.2 FoP對運動疲勞小鼠的抗氧化作用

研究證明，機體的抗氧化系統(tǒng)是一個可與免疫系統(tǒng)相比擬的、具有完善和復(fù)雜功能的系統(tǒng)，運動疲勞狀態(tài)下，機體內(nèi)自由基大量生成，同時自由基清除機制卻呈抑制狀態(tài)，結(jié)果造成體內(nèi)自由基大量積聚，造成組織細胞的損傷[6,7]。由圖2可知，就小鼠血清MDA水平而言，F(xiàn)oP各劑量組顯著低于陽性對照組（P＜0.05），且顯著高于陰性對照組（P＜0.01），陰性對照組顯著低于陽性對照組（P＜0.01）；FoP各組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

FoP各劑量組及陰性對照組血清SOD含量顯著高于陽性對照組（P＜0.05），與陰性對照組比較，F(xiàn)oP各組提升酶活性能力無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 FoP對小鼠IL-4、TNF-α mRNA表達水平的影響

圖3 FoP對運動疲勞小鼠IL-4mRNA、INF-γ mRNA相對表達量的影響

通過對8周運動實驗后小鼠IL-4 mRNA、INF-γ mRNA表達水平的變化情況，可以觀察到陽性對照組IL-4 mRNA、INF-γ mRNA表達水平相對陰性對照組顯著下降（P＜0.01），說明小鼠經(jīng)遞增負荷跑臺訓(xùn)練處于運動免疫抑制狀態(tài)。FoP各劑量組IL-4 mRNA表達水平顯著高于陽性對照組；INF-γ mRNA表達水平相對陽性對照組顯著上升，其中中、高劑量組與陽性對照組比較出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01）。FoP各劑量組IL-4 mRNA/INF-γ mRNA比值基本處于平衡狀態(tài)，說明FoP各劑量組Th1/Th2免疫水平處于相對平衡狀態(tài)。

3 討論

國內(nèi)外研究表明，運動疲勞尤其是長期疲勞積累狀態(tài)下，機體的抗氧化能力及機能水平會發(fā)生適應(yīng)性變化，運動過程中氧自由基的增加是導(dǎo)致運動性疲勞發(fā)生的一個重要因素[8-9]。HB（血紅蛋白）是運動強度和運動量常用測試指標(biāo)，血紅蛋白主要生理功能是運輸氧和二氧化碳，能綜合反映在運動過程中血液攜帶氧的能力[10]；肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、TP再生有直接關(guān)系的重要激酶，能夠可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)[11-12]。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)oP可以顯著提高運動疲勞小鼠的HB水平，并顯著降低運動疲勞小鼠血清CK濃度，說明FoP具有較好的抗疲勞作用。

機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者可以攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸（Poiyunstaturated Fatty Acid，PUFA），引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物。MDA水平常?？梢苑从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映機體細胞損傷的程度[13]。機體在運動疲勞狀態(tài)下，產(chǎn)生大量氧自由基，雖然機體的自由基清除途徑被激活，但仍然很難徹底清除氧自由基，殘存的氧自由基誘導(dǎo)大量脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而干擾生物膜的正常功能，繼而引發(fā)機體的代謝紊亂[14,15]。本實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)oP可有效降低運動疲勞小鼠血清MDA水平。

SOD能催化清除超氧陰離子自由基的反應(yīng)，在防御生物體免受超氧陰離子自由基損傷、抗輻射、抗腫瘤及延緩機體衰老等方面具有重要的作用[16,17]。本次實驗結(jié)果表明，F(xiàn)oP可明顯提高運動疲勞小鼠血清SOD濃度。

在運動應(yīng)激狀態(tài)下，機體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)激素系統(tǒng)(HPA)失衡，皮質(zhì)醇等激素含量異常升高，通過抗原遞呈細胞胞漿及核內(nèi)受體抑制IL-12產(chǎn)生，從而導(dǎo)致IFN-γ和IL-2含量降低，且NK細胞數(shù)量的減少致使其分泌的IFN-γ含量減少，導(dǎo)致Th1型免疫抑制，Th2型免疫優(yōu)勢[18]。研究結(jié)果表明，F(xiàn)oP作用于運動疲勞小鼠可誘導(dǎo)機體IL-4mRNA、TNF-α mRNA相對表達量的上升，逆轉(zhuǎn)了運動疲勞狀態(tài)下的運動免疫抑制。

維藥阿里紅多糖是一類真菌多糖，其研究價值在近年來得到了廣泛關(guān)注。研究表明，F(xiàn)oP具有改善機體免疫水平、抗運動疲勞和增強免疫活性等作用[19]。本實驗通過遞增負荷跑臺運動得到小鼠長期運動疲勞模型，并通過不同劑量FoP干預(yù)，實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)oP可以顯著改善長期運動疲勞小鼠抗氧化能力及免疫水平，并誘導(dǎo)運動疲勞小鼠IL-4mRNA、INF-γ mRNA相對表達量的上升，從而逆轉(zhuǎn)運動疲勞狀態(tài)下的運動免疫抑制。

1 宋博雅,郝選明.外源性補充Tα1對運動性免疫抑制發(fā)展過程中胸腺組織細胞的抗凋亡效應(yīng).陜西師范大學(xué)學(xué)報(自科版),2017,45(1)：118-124.

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4 叢媛媛,阿地力·阿不力孜,帕麗達·阿不力孜,等.維藥阿里紅多糖的提取及免疫活性研究.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2010,27(7)：569-571.

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12 Kaewseejan N,Sutthikhum V,Siriamornpun S.Potential of Gynura procumbens,leaves as source of flavonoid-enriched fractions with enhanced antioxidant capacity.J Funct Foods,2015,12(4)：120-128.

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Effect of Inhibition of Uygur Fomes Officinalis Polysaccharides onAntioxidant Capacity and Exercise Immunity

Wang Fenghua1,Kong Haijun1,Huang Ling2
(1.Laboratory of Sports Biochemistry,School of Physical Education,Xinjiang Normal University,Urumqi 830054,China;2.Ji'nan ADICON Clinical Center,Jinan 250013,China)

This study was aimed to investigate the effects ofFomes officinalispolysaccharides(FoP)on exercise-induced fatigue and exercise immune suppression in mice with FoP induced by exercise fatigue and unbalanced exercise immunity.Through treadmill exercise,the long-term exercise immune suppression model fatigue was established.Different doses of FoP were used in the animal experiment.The experimental animal were randomly divided into the positive control group,negative control group,low dose FoP(20 mg·kg-1)+exercise group,middle dose FoP(40 mg·kg-1)+exercise group,and the high dose FoP(80 mg·kg-1)+exercise group.The intragastric administration was given 6 days per week for 8 weeks.Treadmill exercise was administered during these 8 weeks.After 8 weeks,the samples were sacrificed.The levels of malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD),hemoglobin(HB)and creatine kinase(CK)were detected by kit.And the relative expression of IL-4mRNA,INF-γ mRNA was detected by RT-PCR.The results showed that compared with the positive control group,FoP can significantly improve the level of HB in mice,the level of serum CK in each FoP dose group was significantly decreased;compared with the positive control group,FoP group can significantly eliminate MDA with no significant difference among different FoP dose groups.The contents of SOD in serum of different dose FoP group and the negative control group were significantly higher than that of the positive control group.The IL-4 mRNA/INF-γ mRNA ratio of different dose FoP group were in basic equilibrium.It was concluded that Uygur FoP can effectively promote the body fatigue recovery,accelerate the clearance of free radicals,and improve the antioxidant ability and immune status.

UygurFomes officinalispolysaccharides,sports fatigue,free radical,antioxidant,exercise immune suppression

10.11842/wst.2017.08.022

R285

A

2017-03-15

修回日期：2017-06-23

＊ 國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31660736）：三倍體虹鱒不育相關(guān)miRNA的鑒定與表達調(diào)控研究，負責(zé)人：王鳳華；2016年新疆維吾爾自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目（XJGRI2016106）：茶多酚+維藥阿里紅對運動疲勞恢復(fù)及血清TH1/TH2平衡干預(yù)研究，負責(zé)人：孔海軍。

＊＊ 通訊作者：王鳳華，博士，副教授，主要研究方向：主要從事運動生物化學(xué)研究。

（責(zé)任編輯：張 靜，責(zé)任譯審：王 晶）