徐 磊沈 雁鐘繼紅王章流鄭華君郭飄婷

姜黃素對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-10表達的影響

徐 磊1沈 雁1鐘繼紅1王章流1鄭華君1郭飄婷2

目的 觀察姜黃素對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型小鼠結(jié)腸組織腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素10（IL-10）表達的影響，探討其治療UC的可能作用機制。方法SPF級健康雄性BALB/c小鼠60只，隨機分為正常對照組、模型組、姜黃素組、柳氮磺胺吡啶（SASP）組，各15只。采用右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）法復制UC小鼠模型，腹腔注射相應藥物，連續(xù)7天。觀察小鼠一般生理狀態(tài)，疾病活動度指數(shù)（DAI）評分。末次給藥后處死小鼠，行結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）評分，組織切片染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織的病理學變化并評估組織損傷指數(shù)（TDI）。ELISA法檢測小鼠結(jié)腸組織促炎因子TNF-α、IL-1β和抗炎因子IL-10表達水平。結(jié)果（1）模型組小鼠大體形態(tài)、組織病理均符合潰瘍性結(jié)腸炎特點。（2）各組DAI評分比較：SASP組[（0.51±0.40）分]、姜黃素組[（0.52±0.36）分]與模型組[（1.38±0.61）分]比較，P＜0.01。（3）各組CMDI評分比較：SASP組[（2.14±0.92）分]、姜黃素組[（2.19±1.10）分]與模型組[（3.83±1.44）分]比較，P＜0.01。（4）各組TDI評分比較：SASP組[（5.48±1.01）分]、姜黃素組[（6.48±1.03）分]與模型組[（8.89±0.88）分]比較，P＜0.01。（5）各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β及IL-10含量比較：SASP組[（126.75±6.16）pg/mL、（157.51±20.43）pg/mL、（156.33±16.51）pg/mL]、姜黃素組[（254.83±28.29）pg/mL、（236.83±25.21）pg/mL、（136.66±16.49）pg/mL]與模型組[（418.19±41.67）pg/mL、（401.11±35.32）pg/mL、（33.96±6.68）pg/mL]比較，P＜0.01。結(jié)論 姜黃素可以顯著改善UC小鼠癥狀、病理形態(tài)，上調(diào)小鼠結(jié)腸組織IL-10表達水平，抑制TNF-α、IL-1β表達水平，達到對UC的抗炎作用。

BALB/c小鼠；潰瘍性結(jié)腸炎；姜黃素；細胞因子

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）發(fā)病機制尚不十分明確，目前普遍認為是環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，腸腔內(nèi)各種抗原通過缺損的腸黏膜屏障發(fā)生易位并暴露于黏膜固有層的免疫系統(tǒng)，啟動腸道天然免疫及獲得性免疫反應，導致腸黏膜屏障損傷、潰瘍、炎性增生等病理改變[1-3]。促炎細胞因子 [如結(jié)腸組織腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素 1β（IL-1β）等]與抑炎細胞因子[如白細胞介素10（IL-10）等]之間的平衡失調(diào)可能是UC患者及動物模型發(fā)病的關(guān)鍵。姜黃主產(chǎn)于浙江溫州瑞安一帶，性寒，味辛，苦，入心、肝、膽經(jīng)，具有破血行氣，通經(jīng)止痛之功效[4]。姜黃素是姜黃醇提物中的主要活性成分，其安全性高，價格低廉，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等廣泛藥理作用[5-9]。研究顯示，姜黃素對UC有確切的作用[10-12]，但對UC結(jié)腸組織細胞因子表達影響的研究報道較少?；谏鲜鲅芯?，擬應用右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導UC小鼠模型，觀察各組小鼠一般生理狀態(tài)、疾病活動度指數(shù)（disease activity index，DAI）、結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)（colon macroscopic damage index，CMDI）、組織損傷指數(shù)（tissue damage index，TDI），評價姜黃素對該模型的治療作用及其對TNF-α、IL-1β和IL-10表達水平的影響，探討姜黃素防治UC的可能機制。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SPF級BALB/c小鼠60只，鼠齡 8 周，體質(zhì)量（20±2）g，購自中國科學院上海實驗動物中心，動物合格證編號：SCXK（滬）2013-0006。

1.1.2 主要藥品與試劑 右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）購自Sigma-Aldrich公司（批號：31404，F(xiàn)luka：5000MW）；姜黃素購自 Sigma-Aldrich 公司（批號：78246，分子量：368.38）；柳氮磺胺吡啶（salazosulfapyridine，SASP）購自 Sigma-Aldrich公司（批號：1636005，分子量：398.39）；TNF-α、IL-1β和IL-10 ELISA試劑盒（均購自Sigma-Aldrich公司，批號：RAB0489、RAB0489、RAB1060）。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機（德國Leica公司）；BX20型熒光顯微鏡攝像機（日本OLYMPUS公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（中國上海精宏醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.2方法

1.2.1 藥物混懸液配制[13-14]根據(jù)正常成人臨床用量及人-小鼠體表面積換算，姜黃素及SASP分別溶于25mL/L的乙醇中配成所需濃度的混懸液（均為30mg/kg的劑量溶于25mL/L的乙醇 1000μL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗分組 將BALB/C小鼠60只按隨機數(shù)字表法分成正常對照組、模型組、姜黃素組、柳氮磺胺吡啶組，每組15只，飼養(yǎng)環(huán)境22℃±1℃恒溫，50%±10%恒濕飼養(yǎng)，保持光照/黑暗時間，每12h一循環(huán)，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2.3 UC模型制備及鑒定[15]采用右旋葡聚糖硫酸鈉法制備UC模型，具體方法參照文獻報道并略有改進[16]：準確配制5%DSS溶液（5mg DSS溶于100mL蒸餾水），正常對照組小鼠每日自由飲用純凈水100mL，其他各組小鼠每日自由飲用5%DSS溶液，連續(xù)2周。造模結(jié)束后第2天各組隨機處死小鼠各1只，觀察結(jié)腸充血水腫情況；結(jié)腸組織HE染色，觀察黏膜充血、水腫、糜爛、潰瘍等的形成及炎癥細胞浸潤，確定模型是否成功。

1.2.4 藥物治療 自造模成功次日起，全部小鼠改為正常飲水，姜黃素治療組和SASP治療組以相應混懸液（均為30mg/kg的劑量溶于25mL/L的乙醇1000μL）每日腹腔注射，模型對照組每日腹腔注射與治療組等體積的乙醇溶液，各組均1天1次，連續(xù)7天。

1.2.5 一般生理狀態(tài)觀察及疾病活動度評分 自造模之日起，每日觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、進食、飲水和活動、體毛、糞便性狀等情況。每日定時稱量小鼠體質(zhì)量，便隱血檢測試紙（四甲基聯(lián)苯胺法）檢測每組小鼠的糞便隱血，試紙反應區(qū)任何位置出現(xiàn)藍綠色，均視為陽性結(jié)果。并參照文獻[17]行疾病活動度評分（DAI），DAI=體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+隱血程度分數(shù)/3。

1.2.6 結(jié)腸組織大體形態(tài)學檢測 藥物治療結(jié)束后，小鼠用10%水合氯醛麻醉，開腹，嚴格無菌條件下取出結(jié)腸組織，對比各組結(jié)腸長度及外觀改變，之后沿腸系膜縱行切開，用冰PBS沖洗干凈，濾紙吸干水分后，觀察結(jié)腸黏膜潰瘍、糜爛、增生等情況，并參照文獻[18]行大體形態(tài)損傷指數(shù)評分（CMDI）。

1.2.7 結(jié)腸組織病理學檢測 距肛門1cm以上取4～6cm病變腸管組織（或依病變部位而定），修整后大小約1.0cm×1.0cm×0.2cm，置于包埋盒于4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋，3～4μm厚，連續(xù)切片，HE染色后光鏡觀察組織形態(tài)學變化，并參照文獻[19]行組織損傷指數(shù)評分（TDI）。

1.2.8 結(jié)腸組織中細胞因子含量檢測 剪取各組結(jié)腸組織并稱重，每50mg加1mL PBS，在液氮條件下研碎，4℃ 3500r/min離心15min，取0.1mL上清液，按ELISA試劑盒說明書步驟測定TNF-α、IL-1β及IL-10的水平。

1.2.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（x±s）表示，組間多重比較采用SNK法（student-newman-keuls法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況比較 治療期間各組均無小鼠死亡。模型組從第3天開始，小鼠均出現(xiàn)不同程度體質(zhì)量下降，精神呆滯、行動緩慢、體毛凌亂黯淡、進食減少、排便次數(shù)增多，糊狀便，癥狀逐步加重，嚴重者出現(xiàn)肉眼血便。姜黃素組和SASP組小鼠體質(zhì)量也相對下降但趨勢較平緩，稀便、血便程度較模型對照組明顯偏輕，且姜黃素組小鼠DAI評分較模型組顯著下降（P＜0.01），見表 1。

2.2 小鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)比較 肉眼可見，模型組小鼠結(jié)腸部位有明顯的糜爛、潰瘍灶、出血點，腸壁顯著變薄，內(nèi)容物較稀，部分黏膜脫落。姜黃素組和SASP組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)明顯改善，未發(fā)現(xiàn)有潰瘍結(jié)節(jié)，腸內(nèi)容物較黏稠。姜黃素治療組CMDI評分顯著優(yōu)于模型組（P＜0.01），見表 2。

表1 各組小鼠治療前后DAI評分比較

注：與模型組比較，*P＜0.01；DAI：疾病活動度指數(shù)；SASP：柳氮磺胺吡啶

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2.3 小鼠結(jié)腸組織病理改變 鏡下可見，模型組結(jié)腸黏膜廣泛潰瘍，組織充血、水腫明顯，部分腸壁凹陷，黏膜上皮細胞排列紊亂、破裂損傷，細胞核聚集、模糊，伴有較顯著的細胞脫落，腸絨毛殘損，組織內(nèi)見大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主；姜黃素組和SASP組結(jié)腸黏膜潰瘍較少并可見已愈合的潰瘍組織，組織水腫明顯減輕，黏膜上皮細胞較整齊，細胞破裂減少，組織內(nèi)炎性細胞浸潤明顯減少?？瞻讓φ战M鏡下可見結(jié)腸黏膜完整、光滑，腺體層次清晰可見，未見糜爛、潰瘍及中性粒細胞浸潤等。姜黃素組TDI評分顯著優(yōu)于模型對照組（P＜0.01），見表2、圖1（插頁）。

表2 各組小鼠CMDI及結(jié)腸黏膜TDI評分比較

表2 各組小鼠CMDI及結(jié)腸黏膜TDI評分比較

注：與模型組比較，*P＜0.01；CMDI：結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)；TDI：組織損傷指數(shù)；SASP：柳氮磺胺吡啶

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2.4 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β及IL-10含量比較 姜黃素和SASP治療后，小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β 含量較模型組均明顯下降（P＜0.01）；各治療組小鼠結(jié)腸組織IL-10含量均明顯高于模型組（P＜0.01），見表 3。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β及 IL-10含量比較

表3 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β及 IL-10含量比較

注：與模型組比較，*P＜0.01；TNF-α：腫瘤壞死因子 α；IL：白細胞介素；SASP：柳氮磺胺吡啶

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3 討論

UC病變主要限于大腸黏膜層和黏膜下層，表現(xiàn)為反復發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便及腹痛，可并發(fā)中毒性巨結(jié)腸、穿孔、大出血、大腸癌等。病情遷延不愈，有終生復發(fā)傾向，已被WHO確認為現(xiàn)代難治病之一[20-22]。目前UC的常用治療藥物包括水楊酸類、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，長期服用副作用較大，生物制劑價格昂貴，不適于臨床廣泛應用。

基于促炎因子和抗炎因子在UC發(fā)病中的重要角色及姜黃素的藥理作用，本實驗成功構(gòu)建了與人類UC相似的DSS所致的小鼠模型，研究結(jié)果顯示，姜黃素能有效改善UC小鼠稀便、便血、體質(zhì)量下降等臨床表現(xiàn)，明顯降低其DAI、CMDI和TDI評分（P＜0.01），表現(xiàn)出良好的臨床療效；DSS誘導后小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β含量明顯升高，IL-10含量降低，而經(jīng)姜黃素干預治療后TNF-α、IL-1β水平均較模型組顯著降低，IL-10水平顯著升高，差異有統(tǒng)學意義（P＜0.01），表現(xiàn)出明確的促炎-抗炎細胞因子平衡的調(diào)控作用和抑制結(jié)腸急性炎癥反應的作用。

研究結(jié)果表明，姜黃素能有效治療DSS誘導的結(jié)腸炎可能與其非選擇性地抑制結(jié)腸組織TNF-α和IL-1β、促進IL-10的表達有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，應繼續(xù)研究TNF-α、IL-1β和IL-10等細胞因子上游的信號轉(zhuǎn)導通路，為臨床提供新的治療靶標和更為有效的藥物。

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Effect of Curcumin on the Expression of TNF-α,IL-1βand IL-10 of Colon Tissue of Mice with Ulcerative Coliti

XU Lei1,SHEN Yan1,ZHONG Jihong1,WANG Zhangliu1,ZHENG Huajun1,GUO Piaoting2

1 Department of Gastroenterology,the Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Department of General Medicine,the Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo investigate the effects of curcumin on the expression of tumor necrosis factor α（TNF-α）,interleukin 1β（IL-1β） and interleukin 10（IL-10） in colon tissue ofmice with ulcerative colitis（UC）,and to explore the possible underlying mechanism.MethodsSixty SPF grade healthy BALB/c mice were randomly divided into four groups:blankgroup,model group,curcumintreatmentgroup,salazosulfapyridine（SASP） group.UC model was established by dextran sulphate sodium,and then daily intraperitoneal injected with the corresponding drugs for 7 days.During the course of experiment,the general conditions of mice were observed,and disease activity index（DAI） were assessed.At the end of treatment,colon tissue was dissected to evaluate the macroscopic damage index（CMDI） and tissue damage index（TDI） by light microscope and to determine the expression of TNF-α,IL-1β and IL-10 by ELISA.ResultsGeneral morphology and histopathology of the model group conforms to the manifestations of ulcerative colitis.The DAI score in SASP group,curcumin group was significant different compared with that in model group（0.51±0.40,0.52±0.36 vs 1.38±0.61,P＜0.01）.The CMDI score was statistically difference among model group,SASP group,andcurcumin group（3.83±1.44,2.14±0.92 and 2.19±1.10,P＜0.01）.The TDI score was decreased in SASP group and curcumin group compared to model group（5.48±1.01,6.48±1.03 vs 8.89±0.88,P＜0.01）.The contents ofTNF-α,IL-1βand IL-10 in colon tissue in model group（418.19±41.67pg/mL,401.11±35.32pg/mL,33.96±6.68pg/mL） also had significant difference compared with those in SASP group（126.75±6.16pg/mL,157.51±20.43pg/mL,156.33±16.51pg/mL） and curcumin group（254.83±28.29pg/mL,236.83±25.21pg/mL,136.66±16.49pg/mL）,with all P＜0.01.ConclusionCurcumin can significantly improve the symptoms and pathological morphology of UC mice by regulating the expression of IL-10 and inhibiting the expression of TNF-α and IL-1β,through which achieving the anti-inflammatory effect of UC.

BALB/c mice;ulcerative colitis;curcumin;cytokine

浙江中醫(yī)藥大學校級科研基金重點項目（No.2015ZZ07）

1浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科（杭州 310005）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院全科醫(yī)學科（杭州 310005）

徐磊：Tel：15968158441；E-mail：supershilling@sina.cn

（收稿：2017-02-05 修回：2017-05-31）