張明貴 ，趙 玲 ，劉 淇 ，魏玉西

（1.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

響應(yīng)面法優(yōu)化鱈魚碎肉水解工藝

張明貴1, 2，趙 玲2，劉 淇2，魏玉西1

（1.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

為探索出鱈魚碎肉的最佳水解工藝條件，以鱈魚碎肉多肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察水解溫度、水解時(shí)間、pH值、加酶量和料液比對(duì)多肽得率的影響，在此基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水解工藝，建立多肽得率與各響應(yīng)因子的回歸方程。結(jié)果表明：各因素對(duì)多肽得率的影響強(qiáng)弱順序?yàn)閜H值＞溫度＞加酶量，鱈魚碎肉水解的最佳工藝條件為水解溫度55.6℃，pH值8.2，加酶量3 250 U/g，在此條件下多肽得率可達(dá)31.02%。

鱈魚；響應(yīng)面法；水解工藝；優(yōu)化

向海洋索取食物、功能蛋白和特殊活性物質(zhì)，已成為世界各沿海國家海洋開發(fā)的一項(xiàng)重要內(nèi)容[1]。海洋生物量約占全球生物總量的一半，其中蘊(yùn)含了大量的生物活性物質(zhì)，尤其是海洋生物的蛋白質(zhì)是制備生物活性肽的理想材料[2]。種類繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的多肽片段，用特異的蛋白酶水解，就能將這些肽段釋放出來。因此，采用生物技術(shù)方法對(duì)水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物蛋白進(jìn)行水解活性肽的高值化開發(fā)，具有良好的發(fā)展前景。

真鱈魚（Gadus macrocephalus）是我國重要的大型冷水性海洋經(jīng)濟(jì)魚種之一，年加工量高達(dá)40×104～50×104t[3]，在加工過程中產(chǎn)生的魚頭、魚皮、魚骨、碎肉等副產(chǎn)物約占總量的30%～40%。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)鱈魚加工副產(chǎn)物進(jìn)行了大量的研究，例如：分別從鱈魚皮和鱈魚骨中提取膠原蛋白，并進(jìn)行抗氧化活性的測定，為制備天然、安全的抗氧化因子提供支持[4-5]；從鱈魚排中分離出免疫活性肽，可明顯促進(jìn)脾細(xì)胞和T細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞吞噬作用[6]；從鱈魚排中成功分離得到對(duì)鈣具有高親和力的寡肽[7]；通過酶解鱈魚皮成功制備具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑活性的降血壓肽[8]。然而，鱈魚碎肉目前尚未得到有效的開發(fā)利用，有關(guān)鱈魚碎肉蛋白水解方面的研究也較少。大分子蛋白經(jīng)酶解后，更有利于后續(xù)的加工利用。筆者以鱈魚碎肉為原料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化多肽的制備工藝，以期為鱈魚碎肉的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試鱈魚碎肉購自煙臺(tái)嘉惠海洋生物科技有限公司。剔除其中的魚鱗、魚鰭和魚皮，65℃烘干，粉碎后過60目篩，收集粉末；加入異丙醇（m︰V=1︰4）脫脂后，真空抽濾，殘?jiān)?5℃烘干，得到脫脂魚粉。

供試酶AP-1由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海洋食品工程實(shí)驗(yàn)室自制。從刺參腸道中篩選得到的一株產(chǎn)堿性蛋白酶的海洋細(xì)菌（該菌株16sRNA序列經(jīng)過分析比對(duì)后，初步判斷其為奈瑟氏球菌科不動(dòng)桿菌屬，相似度為99%），以其為菌種發(fā)酵，獲得酶AP-1，酶活為50 000 U/g。

試驗(yàn)主要試劑有牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司），磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、甲基紅、甲基藍(lán)、無水乙醇和石油醚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸和鹽酸（萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；硼酸（天津博迪化工股份有限公司）。

主要儀器設(shè)備有AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、SXL-1016型馬弗爐（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、LTKC-B1-T型數(shù)顯恒溫振蕩器（國華電器有限公司）、 5804R離心機(jī)（Eppendorf有限公司）、ST310脂肪抽提器（Foss有限公司）、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、UV-2082型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）、PB-10型pH計(jì)（Sartorius公司）、DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）和K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分的測定水分含量參照GB5009.3—2016，采用直接干燥法測定；灰分含量參照GB5009.4—2016，采用高溫灼燒法測定；蛋白質(zhì)含量參照GB5009.5—2016，采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量參照GB5009.6—2016，采用索氏抽提法測定。

1.2.2 多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[9-10]以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 鱈魚多肽的制備取鱈魚粉（精確到0.01 g）配制成0.02 g/mL的鱈魚粉溶液，加入酶AP-1 （精確到0.001 g），用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，于恒溫振蕩水浴鍋中酶解，每10 min校正一次pH值。 酶解完成后，沸水浴滅活5 min，10 000 r/min離心20 min，取上清液，雙縮脲法測定上清液的多肽濃度[11]。根據(jù)公式（1）計(jì)算多肽得率[12]：

式中，η為多肽的理論得率（%），C為多肽濃度（mg/mL），V為多肽溶液的體積（mL），M為鱈魚粉的質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)以多肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察水解溫度（30、40、45、50、55、60℃）、水解時(shí)間（1、2、3、4、5、6 h）、pH 值（6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、加酶量（1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 、3 500 U/g）和料液比（1︰30、1︰40、1︰50、1︰60、1︰70、1︰80）5個(gè)因素對(duì)水解效果的影響。單因素試驗(yàn)過程中其他設(shè)定條件分別為：水解溫度50℃，水解時(shí)間3 h，pH值8.0，加酶量2 500 U/g，料液比1︰50，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，多肽得率為3次結(jié)果的平均值。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)根據(jù) Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[13]，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以多肽得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每一個(gè)自變量按低、中、高3個(gè)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表 1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平

1.2.6 數(shù)據(jù)分析運(yùn)用Design- Expert V8.0.6.1軟件分析數(shù)據(jù)，采用F檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義，獲得回歸模型及響應(yīng)面圖，對(duì)水解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱈魚碎肉的基本成分

經(jīng)測定，鱈魚碎肉中蛋白質(zhì)、灰分、粗脂肪和水分的含量分別為18.71%、0.80%、0.46%和80.10%。

2.2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，牛血清白蛋白濃度在0～5.0 mg范圍內(nèi)與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.115 2x-0.002 1，R2=0.999 8。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2至圖6可知，在單因素試驗(yàn)條件下，鱈魚碎肉水解的適宜條件如下：水解溫度55℃左右，水解時(shí)間5 h左右，pH值8.0左右，適宜的加酶量為3 000 U/g原料左右，料液比為1︰40左右。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

如表2所示，Box-Behnken設(shè)計(jì)共有17個(gè)試驗(yàn)，其中13個(gè)為析因試驗(yàn)，其余4個(gè)為中心試驗(yàn)，析因點(diǎn)為自變量取值所構(gòu)成的三維定點(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域?yàn)橹行狞c(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域重復(fù)4次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。利用Design-Expert V8.0.6.1分析表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見表4。通過二次多元回歸擬合，得到蛋白酶水解鱈魚碎肉的回歸方程為：η=30.45+0.51A+1.36B+0.45C-0.063AB+0.12AC+0.055BC-1.38A2-2.63B2-0.27C2。

圖2 溫度對(duì)多肽得率的影響

圖3 時(shí)間對(duì)多肽得率的影響

圖4 pH值對(duì)多肽得率的影響

圖5 加酶量對(duì)多肽得率的影響

圖6 料液比對(duì)多肽得率的影響

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可以看出，回歸方程F值為34.45，表明模型因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)中一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)多肽得率的影響均達(dá)顯著或極顯著水平，而交互項(xiàng)對(duì)多肽得率的影響不顯著，表明在水解過程中，各個(gè)因素對(duì)多肽得率的影響不是簡單的線性關(guān)系[14]，其中水解溫度、pH值和加酶量對(duì)多肽得率有顯著的影響，各因素之間的交互作用對(duì)其沒有顯著影響。

由統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算出的模型總回歸的相關(guān)性系數(shù)R2=0.977 9，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著可用于該反應(yīng)的理論推測；說明它能解釋94.95%的相應(yīng)值變化，僅有5.05%的相應(yīng)值不能用該模型解釋；殘差、純誤差都比較小，變異系數(shù)為1.06%，信噪比為17.975（＞4），說明可信度比較高，精確性良好，可用于指導(dǎo)模型[15]。由P檢驗(yàn)可得各因素對(duì)多肽得率的影響強(qiáng)弱順序?yàn)閜H值＞水解溫度＞加酶量。

在水解溫度、pH值和加酶量3個(gè)因素中，由圖7可知，pH值對(duì)多肽得率的影響最大，表現(xiàn)為曲面較陡，沿pH值軸方向，多肽得率變化范圍較大；由圖8可知，水解溫度對(duì)多肽得率的影響較大，表現(xiàn)為曲面較陡，沿溫度的軸方向，多肽得率變化范圍較大；由圖9可知，加酶量對(duì)多肽得率的影響較小，沿料液比的軸方向，多肽得率較小。響應(yīng)面法獲得的結(jié)果與方差分析獲得的結(jié)果相吻合[16]。

表3 模型方差分析表

響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型結(jié)果表明，當(dāng)水解溫度為55.61℃，pH值為8.22，加酶量為3 250 U/g時(shí)，理論上多肽得率為30.796 1%。為了試驗(yàn)操作便利，將優(yōu)化得到的工藝條件修正為水解溫度55.6℃，pH值 8.2，加酶量3 250 U/g。在此修正條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到多肽得率為（31.02±0.36）%，說明該模型適宜對(duì)鱈魚碎肉水解工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化鱈魚碎肉水解工藝，得到最佳工藝條件為：水解溫度55.6℃，pH值8.2，加酶量3 250 U/g，在此最優(yōu)條件下，制備的鱈魚碎肉多肽得率可達(dá)31.02%，與理論預(yù)測值基本一致。這表明試驗(yàn)建立的響應(yīng)面模型可用于預(yù)測鱈魚碎肉的酶促水解過程，對(duì)于相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

圖7 水解溫度與pH值對(duì)多肽得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖8 水解溫度與加酶量對(duì)多肽得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖9 pH值與加酶量對(duì)多肽得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

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Optimization of Hydrolysis Conditions of Codfish Minced Meat by Response Surface Methodology

ZHANG Ming-gui1,2，ZHAO Ling2，LIU Qi2，WEI Yu-xi1
（1. College of Life Science, Qingdao University, Qingdao 266071, PRC; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Science, Qingdao 266071, PRC）

In order to explore the optimal hydrolysis conditions for codfish minced meat, the effect of single factors such as temperature,time, pH, dosage of enzyme and material liquid ratio on the yield of polypeptides was analyzed; and Box-Behnken central composite design was carried out to optimize the hydrolysis process and a quadratic regression model was established on the polypeptide rate and response factors in this study. The results showed that the influence of single factors on the yield of polypeptides was that of pH＞ that of temperature＞ that of enzyme dosage, respectively. The optimal hydrolysis conditions were the temperature at 55.6 ℃ , the pH at 8.2, and the enzyme dosage at 3 250 U/g, under which the yield of polypeptides could be 31.02%.

codfish; response surface methodology; hydrolysis process; optimization

TQ925+.2

A

1006-060X（2017）09-0084-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.021

2017-07-05

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2016HY-ZD1002）

張明貴（1991-），男，山東德州市人，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸镔Y源的開發(fā)與利用。

劉 淇

（責(zé)任編輯：成 平）