朱啟會，高澤鑫，何臘平，2*，高 冰，李翠芹，熊 江，張富豪

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；4.貴州大學 化學與化工學院貴州 貴陽 550025）

產(chǎn)水解銀杏黃酮苷的β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及鑒定

朱啟會1，高澤鑫1，何臘平1，2*，高 冰3，李翠芹4，熊 江1，張富豪1

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；4.貴州大學 化學與化工學院貴州 貴陽 550025）

以銀杏提取物為唯一碳源，利用梔子苷-谷氨酸鈉顯色法，從貴州銀杏樹土壤樣品中分離產(chǎn)水解銀杏黃酮苷的β-葡萄糖苷酶菌株。采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定β-葡萄糖苷酶酶活。得到一株酶活為1.03 U/mL的菌株NY-13，并且該菌株能水解蘆丁生成槲皮素。經(jīng)生理生化特征及16S rRNA分子生物學鑒定，菌株NY-13為解鳥氨酸柔武氏菌（Raoultella ornithinolytica）。

β-葡萄糖苷酶；銀杏黃酮苷；篩選鑒定；解鳥氨酸柔武氏菌

銀杏葉（Ginkgo bi1obaL.）提取物中的黃酮類物質主要是以黃酮糖苷的形式存在，占銀杏葉提取物總含量的22%～24%[1]。主要是由山奈酚、槲皮素以及異鼠李素等黃酮苷元與葡萄糖等單糖以O-糖苷鍵連接而成，以糖苷鍵形式存在的黃酮占到提取物黃酮總含量的95%[2]。銀杏黃酮類物質是治療心血管疾病的天然藥物[3]，具有降低全血黏稠度、擴張血管、增加血流量、抗氧化等作用[4-5]，除此之外，銀杏黃酮類物質在防治青光眼、糖尿病，抗癌、抗菌、抗衰老等方面也有顯著的效果[6-7]。由于銀杏黃酮大部分以糖苷形式存在，少部分以苷元型黃酮形式存在，不易被腸道吸收，難以達到療效。經(jīng)體外抗自由基氧化實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃酮苷元清除自由基的能力比黃酮苷強，苷元抗氧化能力也明顯優(yōu)于黃酮苷。因此，將黃酮苷轉化為黃酮苷元的研究吸引了多數(shù)人的目光。

β-葡萄糖苷酶能參與水解黃酮苷類化合物的各種糖苷鍵，能水解O-糖苷以及C-糖苷，生成黃酮苷元被大腸直接吸收[8]。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于真菌、細菌和植物中，來源廣泛。伍毅等[3]采用固定商業(yè)β-葡萄糖苷酶水解銀杏黃酮苷，取得了較好結果。但是，利用非商業(yè)β-葡萄糖苷酶水解銀杏黃酮苷還極少見報道。由于商業(yè)β-葡萄糖苷酶價格昂貴，因此，本發(fā)明選擇自己篩選產(chǎn)水解銀杏黃酮的β-葡萄糖苷酶的菌株，為銀杏黃酮苷元的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎，降低轉化成本。大量掉落的銀杏葉被土壤中的微生物分解利用，可認為土壤中含有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶且能生物利用銀杏黃酮的微生物。本研究主要從銀杏樹下的土壤中分離篩選出能生物利用銀杏黃酮苷高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，并利用該菌株轉化銀杏黃酮苷生成利于吸收的黃酮苷元，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)銀杏黃酮苷元提供有利條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤樣品：貴州大學南校區(qū)銀杏樹下土壤。

種子培養(yǎng)基：硫酸銨2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈉2 g/L，碳酸鈣2 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，銀杏葉提取物5 g/L。

篩選培養(yǎng)基：銀杏葉提取物5 g/L，瓊脂20 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀10 g/L，梔子苷0.1 g/L，谷氨酸鈉10 g/L，硫酸銨2 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L。

銀杏提取物：西安瑞盈生物有限公司；谷氨酸鈉（分析純）：索萊寶生物科技有限公司；水楊苷：西安欣祿生物科技有限公司；葡萄糖（分析純）：上海國藥集團；蘆丁標準品（色譜純）：上海源葉生物有限公司；甲醇（色譜純）：天津市富宇精細化工有限公司；甲酸（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-10超凈工作臺：蘇州凈化有限公司；LS-B75L立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；101-1ASB電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；DW-86L286立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；TU-1810PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；pHS-3C pH計：成都世紀方舟科技有限公司；1260型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株初篩

稱取5 g土壤樣品，加入45 mL滅菌備用的種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；取上清液用0.85%生理鹽水稀釋，分別取10-3～10-8梯度的稀釋液200 μL涂布于篩選培養(yǎng)基上，分別于28℃和37℃培養(yǎng)48 h后，挑選藍色菌圈較大、顏色較深的單菌落進行純化培養(yǎng)。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為單一菌種后，斜面保藏和甘油保藏備用。

1.3.2 菌株復篩

挑取一環(huán)斜面保藏的初篩菌株接入種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，按照8%的接種量接入揺瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液酶活，篩選產(chǎn)酶最高菌株。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶酶活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[9-10]測定β-葡萄糖苷酶酶活力：發(fā)酵液經(jīng)細胞破碎后，8 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液為粗酶液。取15 mL具塞刻度試管加入底物（1%水楊苷）1.8mL，50℃預熱3min，加入粗酶液0.2 mL，50℃水浴30 min，加入DNS試劑3 mL，沸水浴10min，冷卻至室溫，定容至15mL。以滅活的酶液為空白對照，于波長540 nm處測定吸光度值。根據(jù)葡萄糖標準溶液回歸方程計算粗酶液中葡萄糖質量濃度。

酶活力單位定義：在測定條件下，每分鐘水解水楊苷產(chǎn)生1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

葡萄糖標準曲線的繪制：吸取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于具塞刻度試管中，補水至2 mL，加DNS試劑3 mL，混合后于沸水中煮10 min，冷卻后加水定容至15 mL，于波長540 nm處測吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標，葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，獲得線性回歸方程為：y=0.465x-0.004，相關系數(shù)R2=0.999。

1.3.4 銀杏黃酮苷生物轉化

粗酶液制備：從斜面培養(yǎng)基上挑取2環(huán)菌種，接種于裝液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，按8%接種量接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h，發(fā)酵液經(jīng)細胞破碎后，4℃、8000r/min離心10 min，取上清液為粗酶液。

銀杏黃酮苷生物轉化：取粗酶液9 mL，加入1 mL 0.34 mg/mL的蘆丁標準品溶液，50℃、180 r/min搖床振蕩轉化4 h，經(jīng)0.45 μm膜過濾后用HPLC檢測轉化結果。

銀杏黃酮苷高效液相色譜檢測條件[11]：以1%甲酸（A）和甲醇（B）為流動相進行梯度洗脫，洗脫順序如表1所示，流速0.5mL/min，進樣量5μL，柱溫30℃，檢測波長360 nm，WatersC18反相色譜柱（4μm，3.9mm×150 mm）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.5 菌株形態(tài)特征及生理生化試驗

對獲得的可產(chǎn)水解銀杏黃酮苷的β-葡萄糖苷酶的菌株進行形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察，依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》對菌種進行生理生化特征的測定，觀察并記錄結果[12]。

1.3.6 16S rRNA分子生物學鑒定

DNA提取：從斜面中直接挑取一環(huán)菌，加入100 μL無菌水中，混勻后，沸水浴2 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液用于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

反應體系：擴增反應體積50 μL，5×PCR buffer 5 μL；2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2μL；Taq酶0.4μL，模板1μL；10μmol/L正向引物和反向引物各1 μL；加雙蒸水至50 μL。

擴增條件：95℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共進行29個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物檢測：擴增反應完畢后，取產(chǎn)物與加樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品加入到預先制備0.8%的瓊脂糖凝膠的加樣孔中進行電泳，電泳完后在紫外檢測儀下觀察。

序列分析：使用BLAST在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索。從GeneBank中選擇近緣菌株的部分菌的基因序列，采用生物學軟件MEGA5.0構建系統(tǒng)進化樹，從而確定菌株的分類地位及親緣關系。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

表2 初篩菌株的β-葡萄糖苷酶酶活及菌落形態(tài)Table 2 β-glucosidase activity and colony morphology of the preliminary screening strains

圖1 篩選菌株菌落形態(tài)（A）和菌體特征（B）Fig.1 Colony morphology(A)and bacteria characteristics(B)of screened strain

利用微生物產(chǎn)β-葡萄糖苷酶水解培養(yǎng)基中的梔子苷產(chǎn)生梔子苷元，與谷氨酸鈉結合形成藍色梔子苷藍[13-14]，共從銀杏樹下土壤樣品中篩選出20株具有藍色菌圈的菌株，用DNS法測定20株菌的β-葡萄糖苷酶酶活力，結果見表2。由表2可知，其中酶活最高的為菌株NY-13（1.03 U/mL），在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后可產(chǎn)生較大藍色菌圈，菌落呈白色，濕潤，革蘭氏陰性桿菌（見圖1）。為進一步確定菌株對銀杏黃酮苷的生物利用情況，選擇菌株NY-13進行下一步銀杏黃酮苷的生物轉化試驗。

2.2 銀杏黃酮苷生物轉化

圖2 蘆丁標準品（A）、槲皮素標準品（B）和菌株NY-13粗酶液轉化蘆?。–）高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of rutin standard(A),quercetin standard(B)and rutin transformed by crude enzyme solution of strain NY-13(C)

按照1.3.4方法進行銀杏黃酮苷轉化，并用高效液相色譜儀檢測其轉化結果。用酸水解銀杏黃酮苷可水解所有的糖苷鍵生成黃酮苷元，但是由于酸解條件激烈且酸對環(huán)境有一定的影響，其酸解產(chǎn)物在用于食品或保健品時對產(chǎn)物的安全性和穩(wěn)定性有一定的考慮；而且酸解破壞了銀杏葉提取物中的其他活性成分。采用酶水解銀杏黃酮苷反應條件溫和，安全性高，產(chǎn)物較穩(wěn)定。為方便觀察菌株對銀杏黃酮苷的轉化結果，這里選擇銀杏黃酮中的主要成分之一蘆丁標準品為水解底物，檢測β-葡萄糖苷酶對銀杏黃酮苷的水解作用。菌株NY-13粗酶液轉化蘆丁結果如圖2所示。由圖2A可知，蘆丁標準品的出峰時間為14.911 min，由圖2B可知，槲皮素標準品的出峰時間為20.774 min，由圖2C可知，在20.716 min有色譜峰出現(xiàn)，表明菌株NY-13的粗酶液可轉化蘆丁生成槲皮素。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化特性

依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》對菌種進行生理生化特征的測定，菌株NY-13生理生化特征見表3。由表3可知，菌株NY-13吲哚試驗、檸檬酸鹽利用、尿素分解為陽性反應，H2S產(chǎn)氣及明膠分解呈陰性反應，與鄭艷等[15]篩選的土生拉烏爾菌生理生化試驗一致。菌株NY-13可水解利用七葉靈、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、熊果苷、L-阿拉伯糖等物質，不能水解利用苦杏仁苷、D-阿拉伯糖等化合物，可見菌株NY-13可水解部分糖苷鍵。

表3 菌株NY-13生理生化特性Table 3 Strain NY-13 physiological and biochemical characteristics,enzyme activity,carbon source oxidation

2.3.2 分子生物學鑒定

采用瓊脂糖凝膠對菌株NY-13的PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。將所測得的16S rRNA基因序列提交到NCBI，通過Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取同源性較高菌株構用MEGA5.0建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖3所示。

圖3 基于16S rRNA基因序列的菌株NY-13系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NY-13 based on 16S rRNA gene sequence

由圖3可知，菌株NY-13與解鳥氨酸柔武氏菌（Raoultella ornithinolytica）JCM 6096（T）屬于同一個最小分支，且同源性為69%，結合菌落形態(tài)、生理生化特性，菌株NY-13被鑒定為解鳥氨酸柔武氏菌（Raoultella ornithinolytica）。

3 結論

本研究以銀杏葉提取物為唯一碳源，利用梔子苷—谷氨酸鈉顯色法，從銀杏樹下土壤樣品中篩選產(chǎn)水解銀杏黃酮的β-葡萄糖苷酶的菌株。根據(jù)酶活力測定及銀杏黃酮轉化檢測，得到菌株NY-13的β-葡萄糖苷酶酶活力最高且能水解銀杏葉提取物中的主要物質蘆丁生成槲皮素。經(jīng)形態(tài)學、生理生化試驗和16SrRNA生物分子學鑒定，菌株NY-13為鳥氨酸柔武氏菌（Raoultella ornithinolytica）。豐富了β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的菌種資源，也為其在轉化銀杏黃酮苷生成苷元方面的應用奠定基礎。

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Screening and identification of β-glucosidase-producing strain with hydrolysis of Ginkgo bilobaflavonoid glycoside

ZHU Qihui1,GAO Zexin1,HE Laping1,2*,GAO Bing3,LI Cuiqin4,XIONG Jiang1,ZHANG Fuhao1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using theGinkgo bilobaextract as the sole carbon source,by the geniposide-sodium glutamate color method,the β-glucosidase-producing strain which hydrolyzedGinkgo bilobaflavonoid glycoside was screened from GuizhouGinkgo bilobatrees soil samples.The β-glucosidase activity was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS).A strain NY-13 with 1.03 U/ml of β-glucosidase activity was obtained,and the strain could hydrolyze rutin to produce quercetin.Through physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA molecular biological identification,strain NY-13 was identified asRaoultella ornithinolytica.

β-glucosidase;Ginkgo bilobaflavonoid glycoside;screening and identification;Raoultella ornithinolytica

TQ920.6

0254-5071（2017）09-0102-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.022

2017-04-28

國家自然科學基金（31160002）；黔科合重大專項字[2015]6004-5號；黔科合支撐[2016]2580號

朱啟會（1992-），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程、生物催化與生物轉化。