彭翠珍，宗緒巖，4，徐 勇，沈小娟，3，彭遠松，3，雷翔云，3，張宿義，3，4*，李 建，陳 飛

（1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000；4.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；5.重慶大學 生物工程學院，重慶 400030）

釀酒廢水產微生物絮凝劑菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

彭翠珍1，宗緒巖1，4，徐 勇2，沈小娟2，3，彭遠松2，3，雷翔云2，3，張宿義2，3，4*，李 建1，陳 飛5

（1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000；4.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；5.重慶大學 生物工程學院，重慶 400030）

該研究采用平板劃線法、液體發(fā)酵篩選獲得產絮凝劑菌株，命名為Y1，采用形態(tài)學觀察、16S rDNA測序及系統(tǒng)進化樹分析進行鑒定；并在單因素試驗基礎上，采用響應面試驗設計方法優(yōu)化菌株Y1的發(fā)酵條件。結果表明，菌株Y1為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），最佳發(fā)酵條件為初始pH7.4，轉速147 r/min，溫度35℃，接種量8%。在最佳發(fā)酵條件下，絮凝率為81.6%。

釀酒廢水；菌種篩選；微生物絮凝劑；發(fā)酵條件；優(yōu)化

微生物絮凝劑（microbial flocculants，MBF）是由糖類、蛋白質、纖維素和核酸組成的高分子化合物，利用微生物純培養(yǎng)技術，經細菌、真菌、霉菌等微生物發(fā)酵、提純獲得[1]。傳統(tǒng)無機化學絮凝劑及有機高分子合成絮凝劑難降解、絮凝活性不佳、易造成二次污染，對人體有害；MBF可降解性高、應用范圍廣、對環(huán)境無二次污染，與化學絮凝劑相比，具有一定的明顯優(yōu)勢[2-3]。微生物發(fā)酵產絮凝劑因穩(wěn)定性不強、適應性差、發(fā)酵周期較長、成本高等缺點，工業(yè)化應用較難[4-6]。

白酒廢水屬于高濃度有機廢水，富含香味物質、淀粉、還原糖、有機酸、酯類、醇類等，有機物的降解是廢水處理的關鍵[7-8]。目前，釀酒廢水采用過濾、重力沉降、氣浮、酸堿中和、微生物降解等方法進行處理，其中使用的化學絮凝劑有毒，并且易造成二次污染，微生物絮凝劑無毒、無污染，是其理想的替代產品[9-10]。該研究以篩選利用釀酒廢水發(fā)酵產微生物絮凝劑的菌種、探索廢水資源化利用途徑為目的，采用平板劃線和液體發(fā)酵從活性污泥中篩選到產絮凝劑的菌株；利用單因素和響應面法對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為該菌種利用廢水培養(yǎng)基的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性污泥及釀酒廢水采自某名優(yōu)酒廠公司污水處理站，使用前調節(jié)pH 7.0。

氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、尿素、七水硫酸鎂、碘化鉀、碘：成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、酵母膏、蛋白胨：北京奧博星生物科技有限公司；高嶺土：天津市恒興化學試劑制造有限公司。

種子液培養(yǎng)基：氯化鈉0.5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏3g/L；

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母膏0.5 g/L、氯化鈉0.5g/L、磷酸氫二鉀5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸銨0.2g/L、尿素0.5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L，pH 7.5；

廢水發(fā)酵培養(yǎng)基：廢水化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）10 000 mg/L 、氨氮78 mg/L、pH 4.79。

1.2 儀器與設備

UV-1600PC型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；SW-CJ-2D型雙人無菌工作臺：蘇州凈化有限公司；YXQ-LS100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋、BSD-YX320型智能精密搖床：上海博訊實業(yè)有限公司；DHG-9123A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；PS-3600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DT1002A型電子天平：成都晟杰科技有限公司；ZHP-160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海鴻都科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的分離和篩選

稱取10g樣品溶于90mL無菌水，180r/min振蕩20min。稀釋10-5、10-6、10-7后，取1 mL菌液涂布于瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。采用平板劃線法純化菌株，重復實驗直至獲得純菌落。接斜面，4℃保存。

初篩：挑斜面菌種接入裝有100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h作種子液。10 mL種子液接種到90 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min條件下發(fā)酵72 h。測定發(fā)酵液的絮凝率，選出絮凝率＞60%的菌株。

復篩：10 mL種子液接種到90 mL釀酒廢水中，30℃、150 r/min條件下發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵液的絮凝率，選擇絮凝率最大的菌株。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）形態(tài)鑒定

觀察菌株的瓊脂平板菌落形態(tài)，并采用革蘭氏染色法[11]，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

（2）分子生物學鑒定

DNA提?。喊碨K8255（細菌）試劑盒操作提取待測菌株的全基因組DNA并以其為模板。

16SrDNA序列擴增及測序：以細菌通用引物F27/R1492進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16SrDNA。PCR反應體系：模板DNA0.5μL，10×Buffer2.5μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1μL，Tap酶0.2μL，引物各0.5μL，加雙蒸水至25μL。PCR循環(huán)條件：94℃預變性4 min，94℃退火45 s，55℃變性45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃修復10 min，4℃終止反應。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工測序。測序結果提交美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進行Blast同源序列比對分析，MEGA5.0鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析菌株種屬關系[12]。

1.3.3 分析檢測

絮凝率測定方法[13]：稱取4 g高嶺土溶于1 L蒸餾水中，充分攪拌即可。250 mL錐形瓶中加94 mL的高嶺土懸液，4 mL 1%CaCl2溶液和2 mL發(fā)酵液，180 r/min振蕩10 min，靜置10 min后吸取上清液，測定OD550nm值，以蒸餾水作空白對照，重復3次。絮凝率計算公式如下：

式中：A為對照組上清液的OD550nm的值；B為實驗組上清液的OD550nm值。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

生長曲線及最佳發(fā)酵時間：在上述最佳條件下，每隔一段時間（24h內間隔3h，60h內間隔6h，以后間隔12h）取樣，按1.3.3方法測絮凝率，以液體培養(yǎng)基作空白測定OD600nm值，確定最佳發(fā)酵時間。

按初篩方法發(fā)酵，考察培養(yǎng)基不同初始pH（5、6、7、8、9）、培養(yǎng)溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃）、轉速（140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min、180 r/min）、接種量（6%、8%、10%、12%、14%）對發(fā)酵液絮凝率的影響，絮凝率測定方法按照1.3.3進行。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計

以單因素試驗結果基礎為中心點，根據Box-Behnken中心組合實驗原理[14]，運用Design Expert 8.0軟件以初始pH（X1）、轉速（X2）、溫度（X3）、接種量（X4）為評價因素，以絮凝率（Y）為響應值，設計4因素3水平的響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選結果

采用平板劃線法，從活性污泥中分離獲得21株純菌株，經初篩和復篩，篩選出5株利用釀酒廢水產絮凝劑活性較強的菌株，分別命名為Y1、Y6、Y8、H5、H8。如圖 1所示，各菌株的絮凝率＞60%，Y1的絮凝活性最佳為65.8%，選擇該菌株為后期實驗研究對象。

圖1 不同菌株的絮凝率Fig.1 Flocculation rate of different strains

2.1.1 菌株Y1形態(tài)特征

由圖2A可知，菌株Y1的菌落接近圓形，直徑3～6 mm，凸起，邊緣淺裂，表面呈蠟質狀、乳白色。由圖2B可知，菌株的革蘭氏染色呈陽性，菌體呈桿狀。

圖2 菌株Y1的菌落形態(tài)(A)與細胞形態(tài)(B)Fig.2 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of strain Y1

2.1.2 菌株Y1的分子生物學鑒定

根據復篩結果，選菌株Y1進行16S rDNA序列鑒定，提取菌株Y1的基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。由圖3可知，PCR擴增產物序列長度約為1 437 bp。

圖3 菌株Y1 16S rDNA基因序列PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of 16S rDNA gene sequence of strain Y1

將該序列提交GenBank，登錄號為U73Y32KV016。將已測序列與GenBank數據庫中的核酸數據進行同源性對比，采用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，如圖4所示。由圖4可知，該序列與數據庫中的Bacillus屬的菌株有99%～100%高度相似序列，鑒定菌株Y1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 菌株Y1的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain Y1

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵時間的確定

菌株Y1的pH、菌體生長量和絮凝率隨發(fā)酵時間變化情況如圖5所示。由圖5可知，菌株Y1的延滯期為6 h，6～24 h內為對數生長期，24 h進入穩(wěn)定期。絮凝率變化不同于生長曲線，24 h內，絮凝率變化緩慢，24 h后變化速度加快，直至54 h，絮凝率最大為79.3%，此時菌體進入衰亡期，之后絮凝率有所降低。整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH呈現下降趨勢，發(fā)酵完成時發(fā)酵液呈微酸性。根據實驗結果，確定菌株Y1的最佳發(fā)酵時間54 h。

圖5 菌株Y1生長量、絮凝率、pH隨培養(yǎng)時間變化曲線Fig.5 Change curves of the growth,flocculation rate and pH of strain Y1 with time

2.2.2 初始pH對發(fā)酵液絮凝率的影響

pH值是影響微生物生長和代謝的重要因素之一，pH偏高或偏低時會影響微生物的生長和代謝產物的形成[15]。由圖6可知，菌株Y1在初始pH值為5～7范圍內，絮凝率隨pH值的增加而增加；在pH值為7時，絮凝率最大為69.9%；當pH＞7，絮凝率隨初始pH值的增加而下降。因此，最佳的培養(yǎng)基初始pH為7。

圖6 培養(yǎng)基初始pH對絮凝率的影響Fig.6 Effect of medium initial pH on flocculation rate

2.2.3 溫度對發(fā)酵液絮凝率的影響

圖7 溫度對絮凝率的影響Fig.7 Effect of temperature on flocculation rate

由圖7可知，溫度為26～36℃時，絮凝率均＞60%；溫度為36℃時，絮凝率最大，為78.4%；當溫度＞36℃時，絮凝率有下降。單因素試驗發(fā)現34℃發(fā)酵產絮凝劑的絮凝率和36℃條件下幾近相同，因此，最佳溫度選擇35℃[16]。

2.2.4 搖床轉速對發(fā)酵液絮凝率的影響

圖8 轉速對絮凝率的影響Fig.8 Effect of rotate speed on flocculation rate

搖床轉速影響發(fā)酵過程的溶氧，從而需要菌中的生長與代謝[17]。由圖8可知，轉速為140～180 r/min時，絮凝率先增加后降低；當轉速為150 r/min時，絮凝率最大，為80.7%。因此，選擇最佳轉速為150 r/min。

2.2.5 接種量對發(fā)酵液絮凝率的影響

圖9 接種量對絮凝率的影響Fig.9 Effect of inoculum on flocculation rate

由圖9可知，接種量在4%～8%內，絮凝率呈上升趨勢，按8%接種，最大絮凝率為79.6%，當接種量＞10%，絮凝率有所降低?？刂平臃N量，有益于微生物的生長，能夠提高絮凝劑產量和絮凝活性[18]，因此，選擇最佳接種量為8%。

2.3 響應面試驗結果與分析

運用Design Expert 8.0.6軟件，以絮凝率（Y）為響應值，對初始pH、轉速、溫度及接種量這幾個因素進行4因素3水平Box-Behnken試驗，試驗設計與結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計與結果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

續(xù)表

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

應用回歸分析對方程和方程的各因子進行方差分析，結果如表5所示。由表5可知，以絮凝率為響應值，回歸方程顯著性檢測P為0.000 1，表明該二次方程模型及顯著，模型的決定系數R2=0.898 0；模型的調整確定系數R2Adj=0.795 9，表明回歸方程和實際試驗擬合較好，實驗誤差小，證明用響應面法優(yōu)化絮凝率發(fā)酵條件可行。各因素對絮凝率的影響次序依次為：pH＞接種量＞轉速＞溫度。回歸擬合方程為：

Design Expert軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析，結果見圖10。等高線圖直觀反應2個變量間的交互作用的顯著程度，圓形表示因素之間交互作用不顯著，橢圓行表示交互作用顯著[19]。由圖10可知，pH與轉速、pH與溫度、轉速與溫度、轉速與接種量、溫度與接種量的交互作用對絮凝率的影響均顯著（P＜0.05）；pH與接種量的交互作用不顯著（P＞0.05）。軟件分析出優(yōu)化發(fā)酵條件為：初始pH7.4，轉速146.6 r/min，溫度35℃，接種量7.8%，預測最大絮凝率為79.1%。為方便實際操作，修改最佳發(fā)酵條件為初始pH7.4，轉速147 r/min，溫度35℃，接種量8%，重復3次試驗，絮凝率為81.6%，與預測值79.1%相差2.5%，說明該方程與實際情況擬合較好。

圖10 初始pH、溫度、轉速、接種量交互作用對絮凝率影響的響應面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH，temperature,rotate speed and inoculum on flocculation rate

3 結論

從釀酒廢水處理站的活性污泥中篩選出能利用釀酒廢水發(fā)酵產絮凝劑的微生物，經形態(tài)學觀察及16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。單因素和響應面試驗表明菌株產絮凝劑活性最強的發(fā)酵條件為初始pH值7.4，溫度35℃，轉速147 r/min，接種量 8%，發(fā)酵時間54 h。最佳發(fā)酵條件下，絮凝劑的絮凝率可達到81.6%。利用釀酒廢水產微生物絮凝劑菌種的篩選，為利用廉價釀酒廢水培養(yǎng)基發(fā)酵產微生物絮凝劑的研究及應用究奠定了理論基礎。

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Screening of bioflocculant-producing strains from liquor production wastewater and optimization of fermentation conditions

PENG Cuizhen1,ZONG Xuyan1,4,XU Yong2,SHEN Xiaojuan2,3,PENG Yuansong2,3,LEIXiangyun2,3,ZHANG Suyi2,3,4*,LIJian1,CHEN Fei5
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China;2.LuzhouLaojiao Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;3.National Engineering Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou 646000,China;4.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China;5.Biotechnology College,Chongqing University,Chongqing 400030,China)

The bioflocculant-producing strain Y1 was screened and obtained by plate streak method and liquid fermentation,and was identified by morphological observation,16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis.On the basis of single factor experiments,the fermentation conditions of strain Y1 were optimized by response surface experiments.Results showed that strain Y1 was identified asBacillus subtilis.The optimum fermentation conditionswere initialpH7.4,rotate speed 147 r/min,temperature 35℃and inoculum8%.Under the optimumfermentation conditions,the flocculation rate was 81.6%.

liquor production wastewater;strain screening;bioflocculant;fermentation conditions;optimization

TS262.3

0254-5071（2017）09-0092-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.020

2017-07-18

國家重點研發(fā)計劃項目智能上甑機器人的研發(fā)與產業(yè)化（2016YFD0400501-05）；固態(tài)釀造關鍵技術研究四川省院士（專家）工作站開放基金項目（GY2014-01）；固態(tài)釀造關鍵技術研究四川省院士（專家）工作站開放基金項目（GY2016-04）

彭翠珍（1991-），女，碩士研究生，研究方向為釀酒生物技術及應用。

*通訊作者：張宿義（1971-），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為釀酒生物技術及應用。