李 偉，李 佳，王宇鵬，楊 帆，趙 華*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

清香型白酒乳酸利用菌的篩選及鑒定

李 偉，李 佳，王宇鵬，楊 帆，趙 華*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

利用透明圈法，從清香型白酒大曲中篩選出兩株可以產(chǎn)生透明圈的菌株B4-1和B36-1。通過(guò)對(duì)兩株菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果，最終確定兩菌株均為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。單一碳源發(fā)酵及葡萄糖-乳酸混合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，在葡萄糖存在的情況下菌株B4-1和B36-1的乳酸利用量分別為1.91 g/L和1.26 g/L，符合乳酸利用菌的篩選特征。因此兩株菌均可以作為清香型白酒的乳酸利用菌。

透明圈法；乳酸利用菌；菌株鑒定；解淀粉芽孢桿菌

乳酸乙酯和乙酸乙酯是清香型白酒的兩種主體酯類，乳酸和乙酸的量比關(guān)系（乳乙比例）直接影響清香型白酒的口感和質(zhì)量。當(dāng)乳酸乙酯含量過(guò)高時(shí)，會(huì)使酒體沉悶，放香小、欠爽口或有苦澀感；而乙酸乙酯含量過(guò)高則會(huì)使酒體有調(diào)香感[1-2]。清香型白酒由于乳酸乙酯含量過(guò)高造成乳乙比例失衡，感官質(zhì)量下降，是目前普遍存在的問(wèn)題。

乳酸乙酯主要是由乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸，乳酸在轉(zhuǎn)?；缸饔孟律扇轷］o酶A，再在酯酶催化作用下與乙醇酯化生成乳酸乙酯[3-5]。并且由于乳酸乙酯性質(zhì)穩(wěn)定，在白酒發(fā)酵和儲(chǔ)藏過(guò)程中不易降解。而乳酸菌在大曲、環(huán)境、水和原料中大量存在，生產(chǎn)工藝和開(kāi)放式的生產(chǎn)環(huán)境又不能有效控制乳酸菌的數(shù)量[6]。所以，利用微生物減少乳酸乙酯的前體物質(zhì)乳酸的積累是當(dāng)前降低白酒中乳酸乙酯的主要方式。

目前，在濃香型酒中添加丙酸菌將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酸和少量乙酸的研究較多[7-9]。而丙酸及其酯類在清香型白酒中幾乎不存在，利用丙酸菌作為乳酸利用菌不符合清香型白酒香氣成分簡(jiǎn)單，口感清爽、醇凈的特點(diǎn)[10]。淀粉水解產(chǎn)生的葡萄糖等單糖是白酒生產(chǎn)中的主要碳源，也是乳酸利用菌篩選中的主要干擾碳源。能否在葡萄糖等單糖存在的情況下利用乳酸，是菌株能否作為乳酸利用菌的關(guān)鍵指標(biāo)。目前對(duì)于篩選可以將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸的乳酸利用菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此篩選出一株可以將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸的乳酸利用菌對(duì)于降低清香型白酒中乳酸乙酯含量具有重要的意義，不僅可以增加乙酸乙酯的含量，平衡乳酸乙酯與乙酸乙酯比例，而且不會(huì)對(duì)清香型白酒的口感產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌源

清香型大曲粉：取自安徽省績(jī)溪縣龍川酒廠。

1.1.2 試劑

氯化鈉、碘化鉀、乳酸、（NH4）2SO4、MnSO4·H2O、檸檬酸鈉、Na2HPO4·12H2O、CaCl2、NH4H2PO4、氫氧化鈉、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酸水解酪素、甲基紅、濃HCl、酚紅、明膠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4、MgSO4·7H2O、氯仿、異戊醇、乙醇、甲醛次硫酸鈉、碘、胰蛋白胨：上海麥克林生化科技有限公司；FeSO4·7H2O、肌酸：薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；ZnSO4·7H2O：西隴化工股份有限公司；H3BO3、十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）、異丙醇、亞硝酸鈉：北京華威銳科化工有限公司；瓊脂、Tris-HCl（pH8.0）、醋酸鉛試紙：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸銨：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（pH8.0）：北京索萊寶科技有限公司；苯酚、巰基醋酸鈉：北京百靈威科技有限公司；對(duì)二甲基氨基苯甲醛：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；葡萄糖、乳酸、乙酸（色譜級(jí)）：天津市化學(xué)試劑二廠色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基[11]

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂17 g/L，pH=7.0；121℃滅菌20 min。使用時(shí)，添加20 μg/mL的制霉菌素[12-13]抑制霉菌生長(zhǎng)。

Lu-Ye培養(yǎng)基：乳酸5g/L，（NH4）2SO42g/L，Na2HPO4·12H2O 14.3 g/L，KH2PO43 g/L，MnSO4·H2O 0.28 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3mg/L，MgSO4·7H2O0.06mg/L，CaCl21mg/L，CuSO4·5H2O 0.05 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.05 mg/L，H3BO30.05 mg/L，瓊脂15 g/L，pH=7.0；分裝后115℃滅菌30 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基：Lu-Ye培養(yǎng)基+0.3%輕質(zhì)CaCO3。

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：分別以5g/L、10g/L、15g/L葡萄糖代替Lu-Ye培養(yǎng)基中的乳酸，其余成分不變配制液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260Infinity液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；HPX-87H色譜柱：美國(guó)Bio-RAD公司；Lab-1D-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；Mastercycler nexus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Eppendorf公司：生物傳感儀SBA-50：山東省科學(xué)院生物研究所；DYY-4C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

菌種分離：稱取5g大曲粉于100 mL無(wú)菌水中加玻璃珠振蕩均勻，制得菌懸液；吸取200 μL上清菌懸液涂布于營(yíng)養(yǎng)肉湯平板上，在30℃條件下倒置培養(yǎng)3 d，設(shè)置一組平行。以單菌落菌株為目標(biāo)菌株，進(jìn)行下一步篩選。

菌種初篩：挑取上一步分離的單菌落菌株，點(diǎn)樣于Lu-Ye培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3d。觀察菌株的生長(zhǎng)情況，并以生長(zhǎng)良好，菌落較大的菌株為目標(biāo)菌株，進(jìn)行下一步篩選。

菌種復(fù)篩：挑取初篩菌種點(diǎn)樣接種于復(fù)篩培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)3 d，以出現(xiàn)透明圈的菌株為目標(biāo)菌株，進(jìn)行下一步篩選。

菌種純化復(fù)篩：取復(fù)篩菌株于Lu-Ye培養(yǎng)基上進(jìn)行3區(qū)劃線，30℃培養(yǎng)3 d。挑取單菌落接種于復(fù)篩培養(yǎng)基。以出現(xiàn)透明圈的菌株為目標(biāo)菌株。取目標(biāo)菌株于斜面試管劃線，30℃培養(yǎng)3 d后于4℃冰箱保藏備用，作為后續(xù)試驗(yàn)菌種。

1.3.2 培養(yǎng)及生理特征

菌落形態(tài)：將菌種點(diǎn)樣接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3d。在10倍物鏡下觀察并記錄菌種單菌落的大小、形狀、邊緣、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度。

菌體觀察：對(duì)2株菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)，是否產(chǎn)芽孢等。

1.3.3 菌種16S rRNA鑒定

（1）菌種基因組提取：挑取斜面菌種接種于裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的試管中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h并設(shè)置一組平行。按照溶菌酶+SDS法[14]提取菌種基因組。

（2）16S rRNA特異性片段PCR：

引物為細(xì)菌通用引物，引物序列如下：

反應(yīng)體系（25 μL）：Template 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5 mmol/L）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 16 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；53℃退火45 s；72℃延伸1 min；72℃后延伸10 min。

取2～5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，余下的4℃保存?zhèn)溆?。將擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物工程有限公司測(cè)序。利用EZbioCloud（www.ezbiocloud.net）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選擇相似性較高的結(jié)果，利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 生理生化特征

根據(jù)常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)，對(duì)兩株菌進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)。

1.3.5 單一碳源發(fā)酵試驗(yàn)

菌種活化：接種一環(huán)菌種斜面培養(yǎng)物于4 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯試管中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，每個(gè)菌株各設(shè)置一組平行和空白試驗(yàn)。

種子制備：將活化好的菌種接種于100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，接種量為5%，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。

將種子分別接種于裝有200 mL的Lu-Ye培養(yǎng)基和三種不同濃度的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為5%，30℃條件下加入20 mL液體石蠟液封后靜置培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)量剩余乳酸和葡萄糖含量。

1.3.6 混合碳源發(fā)酵試驗(yàn)

以5 g乳酸和5 g葡萄糖替代Lu-Ye培養(yǎng)基中的乳酸，其余成分不變配制液體培養(yǎng)基。菌種活化、種子制備和接種操作同方法1.3.5，共取樣8次，測(cè)樣品菌干質(zhì)量、乳酸、乙酸和葡萄糖含量。

1.3.7 測(cè)定方法

生物量[15]：采用干質(zhì)量法測(cè)定生物量。

葡萄糖含量：采用生物傳感儀進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確配制不同濃度梯度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)量并記錄相應(yīng)電流值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品稀釋后測(cè)電流值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品的葡萄糖含量。

乳酸、乙酸含量：采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

根據(jù)菌株是否在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、Lu-Ye培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，是否可以產(chǎn)生透明圈從大曲中篩選可以利用乳酸產(chǎn)生透明圈的菌株，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌種復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Secondary screening results of strains

由圖1可知，菌株B4-1、B36-1可利用乳酸產(chǎn)生透明圈。因培養(yǎng)基中只有乳酸作為唯一碳源，并加入了CaCO3，所以推測(cè)是由于2株菌利用乳酸產(chǎn)酸與CaCO3反應(yīng)產(chǎn)生透明圈。通過(guò)驗(yàn)證，這2株菌株在純化復(fù)篩后仍可以產(chǎn)透明圈。2株菌的培養(yǎng)及生理特征見(jiàn)表1。

表1 菌株B4-1、B36-1的形態(tài)特征Table 1 Morphological character of strain B4-1 and B36-1

由表1可知，兩株菌都是革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，菌株B36-1觀察到芽孢，兩株菌菌落形態(tài)明顯不同。

2.2 菌株B4-1和B36-1的生理生化特征

對(duì)菌株B4-1和B36-1進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，根據(jù)參考文獻(xiàn)[16-20]，兩株菌均符合解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的生理生化特征，初步鑒定兩株菌都為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

表2 菌株B4-1和B36-1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical property of strain B4-1 and B36-1

2.3 菌種16S rRNA鑒定

將2株菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，按照1.3.3的步驟提取其基因組，并進(jìn)行特異性擴(kuò)增。在0.8%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行DNA電泳檢驗(yàn)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株B4-1和B36-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification products of strain B4-1 and B36-1

由圖2可知，在（1.0～2.5）kbp之間出現(xiàn)一條清晰且無(wú)彌散的條帶，說(shuō)明得到了較高質(zhì)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序，選取相似度較高的比對(duì)結(jié)果利用MEGA7軟件，N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1000，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 菌株B4-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain B4-1

圖4 菌株B36-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain B36-1

由圖3、圖4可知，兩株菌均與芽孢桿菌屬內(nèi)種有較高相似性，且相似度都＞90%。菌株B4-1與B36-1與解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）的自展值分別為95和99，兩株菌均與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）有較高親緣性。

2.4 單一碳源發(fā)酵

對(duì)兩株菌進(jìn)行單一碳源試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 2株菌對(duì)葡萄糖、乳酸利用量的比較Table 3 Utilization comparison of strains on glucose and lactic acid

由表3可知，菌株B4-1與B36-1的平均葡萄糖利用量分別為4.34g/L和4.58g/L，兩株菌對(duì)葡萄糖利用能力相當(dāng)。菌株B4-1與B36-1的平均乳酸利用量分別為4.90 g/L和3.58 g/L，菌株B4-1對(duì)乳酸的利用量較高。由于兩株菌對(duì)葡萄糖、乳酸利用量均＜5 g/L，所以進(jìn)行混合發(fā)酵試驗(yàn)，選用5 g/L乳酸和5 g/L葡萄糖作為混合碳源。

2.5 葡萄糖-乳酸混合發(fā)酵

菌株B4-1葡萄糖-乳酸混合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，菌株B36-1葡萄糖-乳酸混合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 菌株B4-1葡萄糖、乳酸混合發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Results of mixed fermentation with glucose and lactic acid of strain B4-1

由圖5可知，在發(fā)酵過(guò)程中，菌株B4-1的菌體干質(zhì)量可達(dá)到0.614 g/100 mL，證明B4-1在厭氧條件下生長(zhǎng)良好；乳酸和葡萄糖能被同時(shí)利用，利用量分別為1.91g/L和3.65g/L，葡萄糖利用量高于乳酸利用量；乙酸在發(fā)酵中期大量積累，含量為2.68 g/L。

圖6 菌株B36-1葡萄糖、乳酸混合發(fā)酵結(jié)果Fig.6 Results of mixed fermentation with glucose and lactic acid of strain B36-1

由圖6可知，在發(fā)酵過(guò)程中，菌株B36-1菌體干質(zhì)量可達(dá)到0.774 g/100 mL，略大于菌株B4-1，在厭氧條件下生長(zhǎng)良好；乳酸、葡萄糖的利用趨勢(shì)同菌株B4-1相同，利用量分別為1.26 g/L和4.61 g/L；乙酸在發(fā)酵中期大量積累，含量為2.35 g/L，但積累量低于菌株B4-1發(fā)酵過(guò)程中的乳酸含量。

3 結(jié)論

利用透明圈法，從清香型白酒大曲中篩選出兩株可以產(chǎn)生透明圈的菌株B4-1和B36-1。通過(guò)對(duì)兩株菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果，最后確定兩菌株均為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。單一碳源發(fā)酵試驗(yàn)表明，兩株菌對(duì)葡萄糖、乳酸利用量均＜5 g/L；葡萄糖-乳酸混合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，在葡萄糖存在的情況下菌株B4-1和B36-1的乳酸利用量分別為1.91g/L和1.26g/L，符合乳酸利用菌的篩選特征。所以，兩株菌均可以作為清香型白酒的乳酸利用菌。

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Screening and identification of lactic acid-utilizing bacteria from Fen-flavorBaijiu

LI Wei,LI Jia,WANG Yupeng,YANG Fan,ZHAO Hua*
(College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjing 300457,China)

Two strains,named B4-1 and B36-1,were screened from Fen-flavorBaijiu(Chinese liquor)Daqu by transparent circle method.Both strains were identified by16S rRNA gene sequencing,and then phylogenetic tree was established.Combining with physiological and biochemical tests results,the strains were ultimately confirmed asBacillus amyloliquefaciens.Then single carbon source fermentation and mixed carbon sources fermentation with glucose and lactic acid were carried out,and results showed that lactic acid utilization of strains B4-1 and B36-1 were 1.91 g/L and 1.26 g/L,which meet the screening characteristic of lactic acid-utilizing bacteria.Therefore,both strains could be used as lactic acid-utilizing bacteria for Fen-flavorBaijiu.

transparent circle;lactate utilizing bacteria;strain identification;Bacillus amyloliquefaciens

TS262.3

0254-5071（2017）09-0087-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.019

2017-06-26

李 偉（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檩p工技術(shù)與工程。

*通訊作者：趙 華（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。