芮文君，趙 萍*，邱 悅，楊 恒，劉金濤，王 歡，張 軼

（蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

響應(yīng)面法優(yōu)化白酒糟富里酸的提取工藝

芮文君，趙 萍*，邱 悅，楊 恒，劉金濤，王 歡，張 軼

（蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

根據(jù)腐殖質(zhì)的成因和白酒糟形成過(guò)程之間的相關(guān)聯(lián)系，以鮮、干白酒糟為原料提取白酒糟富里酸，分析干、鮮白酒糟中富里酸的含量變化；對(duì)比水浴提取和超聲提取條件下的富里酸得率，確定提取方法；單因素和響應(yīng)面優(yōu)化法確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，鮮白酒糟中富里酸含量高于干白酒糟；超聲提取法優(yōu)于水浴提取法；富里酸的最佳提取工藝為固液比1∶8.4（g∶mL），pH值11.2，超聲時(shí)間32 min，超聲功率360 W，超聲溫度45℃，富里酸得率達(dá)6.29%。

白酒糟；富里酸；響應(yīng)面；超聲輔助；提取工藝

白酒糟是酒醅發(fā)酵完成后再經(jīng)蒸餾出酒而殘留的混合固形物，因此白酒糟中有相當(dāng)多未利用的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等成分，與酒醅中的營(yíng)養(yǎng)成分相似，只是在數(shù)量上有差別，而且鮮白酒糟的含水量達(dá)60%左右，不僅量大而集中且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富[1-2]。目前，我國(guó)酒廠的固體白酒糟多作為燒柴、飼料或者農(nóng)肥等，而這些利用并沒(méi)有做到物盡其用，加之鮮酒糟因?yàn)楹枯^高所以在利用方面會(huì)提高干燥和運(yùn)輸?shù)瘸杀?，從而?dǎo)致大量白酒糟被隨意丟棄或焚燒[3-4]。鮮白酒糟如果不及時(shí)加以處理，易發(fā)霉變質(zhì)，不僅浪費(fèi)了寶貴的資源，還會(huì)污染周圍環(huán)境。另外由于釀酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了復(fù)雜的生化變化，所以白酒糟中也產(chǎn)生了大量的新成分，如核糖核酸、嘌呤、嘧啶和其他一些次級(jí)代謝等產(chǎn)物[1-6]，對(duì)白酒糟的高值化利用提供了條件。因此，研究白酒糟中的活性成分，提高對(duì)白酒糟的綜合利用，不僅直接影響釀酒生產(chǎn)企業(yè)的發(fā)展，而且同時(shí)對(duì)我國(guó)的資源開(kāi)發(fā)和環(huán)境保護(hù)也具有重要的意義。

腐殖酸中顏色最淺和分子質(zhì)量最低的組分稱為富里酸（fulvic acid，F(xiàn)A），是人類已知的最好天然電解質(zhì)，因?yàn)槠涔δ芑鶊F(tuán)比較密集、溶解性好、滲透力強(qiáng)，所以在某些生物活性方面高于其他組分的腐植酸[7-11]。FA的形成是由微生物的分泌物和植物性化學(xué)物質(zhì)相結(jié)合且在腐殖化（分解）過(guò)程中不斷進(jìn)行結(jié)構(gòu)重組而產(chǎn)生的一種分子結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的有機(jī)物[9，12-14]。白酒醅在長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)質(zhì)的代謝過(guò)程與腐殖質(zhì)的形成過(guò)程非常相似，白酒蒸餾后的酒糟中保留著大量的未被分解的有機(jī)質(zhì)和微生物代謝產(chǎn)物，若能夠充分合理地利用酒糟，不僅可以變廢為寶，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，還能節(jié)約資源保護(hù)環(huán)境。因此，研究白酒糟富里酸（distillers grains fulvic acid，DFA）可為白酒糟的深入研究和綜合利用提供了一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究直接利用白酒的釀造副產(chǎn)物白酒丟糟制備提取DFA，目的在于用更經(jīng)濟(jì)、更方便的手段提取DFA，同時(shí)為DFA的進(jìn)一步研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒糟：甘肅金徽酒業(yè)集團(tuán)提供，水分含量為63.67%的鮮白酒糟按料液比1∶2.5（g∶mL）的比例打成勻漿密封冷凍待用；干白酒糟：鮮白酒糟風(fēng)干后粉碎過(guò)40目篩密封，置于4℃待用。

鹽酸、硫酸：天津博逸化工股份有限公司；氫氧化鈉、焦磷酸鈉、硫酸亞鐵銨：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；重鉻酸鉀、鄰菲羅啉指示劑：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JJ-2組織勻漿機(jī)：常州萬(wàn)豐儀器制造有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器：上海精密儀器儀表有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TDL-5-4離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；PHB-5型便攜式pH計(jì)：中國(guó)杭州雷磁分析儀器廠；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒糟中DFA含量及得率的測(cè)定

DFA的測(cè)定采用容量滴定法，參考GB18877—2009《有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)混肥料》中有機(jī)質(zhì)含量的測(cè)定方法及相關(guān)文獻(xiàn)中FA的測(cè)定方法[15-19]，按下列公式計(jì)算樣品中DFA含量：

式中：0.003為四分之一碳的摩爾質(zhì)量的數(shù)值，g/mmol；V0為滴定空白所消耗的硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V為滴定式樣所消耗的硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C（Fe2+）為硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；k為DFA碳系數(shù)一般取0.5；m為試樣的質(zhì)量，g；a為試樣溶液的總體積，mL；b為測(cè)定時(shí)所取試樣的體積，mL。

DFA得率按下列公式計(jì)算：

式中：m為提取的DFA質(zhì)量，g；M為稱取的白酒糟質(zhì)量，g。

根據(jù)上述方法分別測(cè)量干白酒糟和鮮白酒糟（含水量為63.67%）中DFA含量（以絕干計(jì)，DW），3次重復(fù)[15，21]。

1.3.2 DFA提取方法的優(yōu)選

恒溫水浴提取法：取定量的鮮白酒糟勻漿于250 mL磨口錐形瓶中，加50 mL蒸餾水搖勻，加入1 mL 0.5 mol/L的焦磷酸鈉后再用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至10。充分搖勻后放入溫度為40℃水浴鍋中提取20min，以3900r/min離心15 min，取上清液再抽濾，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)濾液pH至2。冷沉12 h后以3 900 r/min離心15 min，收集上清液即為DFA提取液，旋蒸濃縮后冷凍干燥并稱質(zhì)量[19-24]，計(jì)算得率。

超聲波輔助提取法：步驟同上，將水浴提取條件變?yōu)闇囟?0℃，超聲功率240 W，提取20 min，然后與水浴提取比較得率[19-27]。

1.3.3 不同因素對(duì)DFA提取效果的影響

采用1.3.2優(yōu)選出的提取方法，選取固液比、堿溶pH、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度為影響因素，以DFA得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定各單因素變量后依序?qū)嶒?yàn)選擇最佳單因素的最佳水平為后續(xù)試驗(yàn)[28-33]。

選1.3.2優(yōu)選后的方法，考察不同因素對(duì)DFA提取效果的影響[19-20，22]。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)先將固液比變量定為：1∶2.5、1∶5.0、1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5、1∶15.0（g∶mL）進(jìn)行提?。活A(yù)實(shí)驗(yàn)pH 8～10組的DFA得率變化不明顯，確定固液比后，將pH變量定為8.0、9.0、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5；確定pH后，步驟同上依次按序分別確定超聲功率（240W、300W、360W、420W、480 W、540 W、600 W）、超聲時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）和超聲溫度（20 ℃、30 ℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)DFA提取影響較大的3個(gè)因素確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素和水平，以DFA得率（Y）為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化提取條件[28-33]，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 DFA提取方法的確定

根據(jù)1.3.2的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)比恒溫水浴提取法和超聲波輔助提取法的DFA得率優(yōu)選提取方法。其得率分別為4.16%和5.21%，表明在相同時(shí)間和相同溫度條件下，超聲波輔助提取明顯優(yōu)于水浴加熱提取。超聲波提取是利用超聲空穴破壞細(xì)胞壁從而增加溶劑穿透力，這樣能提高提取效率和縮短提取時(shí)間，以達(dá)到高效、快速提取細(xì)胞內(nèi)容物的一種普遍運(yùn)用的輔助提取方法[25-27]。因此，本試驗(yàn)選擇超聲波輔助法提取DFA。

2.2 不同白酒糟中DFA含量變化

表2 不同白酒糟中富里酸含量Table 2 Fulvic acid contents in different distillers grains

不同白酒糟在不同時(shí)間條件下的DFA含量結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)表2可知，隨著時(shí)間的推移，干白酒糟中DFA含量變化不大，而鮮白酒糟中DFA含量表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，并且鮮白酒糟中的DFA含量明顯高于干白酒糟。因此本試驗(yàn)采用鮮白酒糟直接提取，并密封保存以減小DFA含量的損失，既避免干燥帶來(lái)的成本問(wèn)題又能提高DFA得率[19-23]。

2.3 影響DFA提取的單因素分析

2.3.1 固液比對(duì)DFA提取效果的影響

固液比對(duì)DFA得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著溶劑量的增加，DFA的得率也逐漸增加，當(dāng)固液比為1∶7.5（g∶mL）時(shí)，DFA得率達(dá)到最高，固液比繼續(xù)增加，DFA得率趨于平緩。因此，從提取效果和溶劑用量及降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮，固液比定為1∶7.5（g∶mL）較為適宜。

圖1 固液比對(duì)富里酸得率的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on fulvic acid yield

2.3.2 pH值對(duì)DFA提取效果的影響

pH值對(duì)DFA得率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著堿液pH值的增加，DFA的得率先增加后減小，pH值在8.0～9.5之間時(shí)，DFA得率逐漸增加且增加較快，在10到11之間增加趨勢(shì)趨于平緩，當(dāng)pH=11.0時(shí)，DFA提取率達(dá)到最高。當(dāng)pH＞11.0時(shí)得率開(kāi)始下降且下降趨勢(shì)較快。這可能是由于堿溶物達(dá)到飽和之后，在酸沉?xí)r析出產(chǎn)生更多沉淀，從而影響了DFA的得率。因此，從提取效果和資源節(jié)約方面考慮，選用堿液pH=11.0為最佳值。

圖2 pH值對(duì)富里酸得率的影響Fig.2 Effect of pH on fulvic acid yield

2.3.3 超聲功率對(duì)DFA提取效果的影響

超聲功率對(duì)DAF得率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著超聲功率的增加，DFA得率先增加后減小，不過(guò)整體變化幅度不大，在超聲功率為360 W時(shí)得率達(dá)到最大，之后開(kāi)始下降，可能是較高的超聲功率促進(jìn)了溶液中各成分的相互作用，發(fā)生聚合氧化等反應(yīng)從而降低DFA得率。所以將360 W定為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率對(duì)富里酸得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on fulvic acid yield

2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)DFA提取效果的影響

超聲時(shí)間對(duì)DFA得率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，超聲時(shí)間在10～30 min內(nèi)隨著超聲時(shí)間的增加，DFA得率增加相對(duì)較顯著，超聲時(shí)間為30 min時(shí)，DFA得率最大，當(dāng)超聲時(shí)間在30～60 min內(nèi)，當(dāng)DFA得率開(kāi)始下降，但下降趨勢(shì)較緩慢。分析原因可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，堿溶物發(fā)生降解、氧化或相互之間縮合等反應(yīng)的幾率也相應(yīng)增高，所以酸沉?xí)r會(huì)產(chǎn)生更多沉淀從而影響得率，而且過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間也可能使白酒糟中的其他物質(zhì)溶出使DFA含更多雜質(zhì)，從而影響得率。綜合考慮提取效果和節(jié)能等因素，選取30 min為最佳超聲時(shí)間。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)富里酸得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on fulvic acid yield

2.3.5 超聲溫度對(duì)DFA提取效果的影響

超聲溫度對(duì)DFA得率的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，超聲溫度在25～45℃之間時(shí)，隨著超聲溫度的升高DFA的得率也在增加，不過(guò)整體增加幅度相對(duì)較小，但當(dāng)超聲溫度高于45℃低于55℃時(shí)，隨著溫度的升高得率開(kāi)始緩慢下降，超聲溫度高于60℃時(shí)，DFA得率下降迅速。分析原因可能是較高的超聲溫度促進(jìn)了溶液中各成分之間的相互作用以及分解縮合氧化等反應(yīng)使得率下降，或是高溫不利于DFA的穩(wěn)定，從而影響了DFA得率。所以將45℃定為最佳超聲溫度。

圖5 超聲溫度對(duì)富里酸得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on fulvic acid yield

2.4 影響DFA提取因素的響應(yīng)面分析

2.4.1 不同因素對(duì)DFA提取效果的影響

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素對(duì)DFA提取效果的影響，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇固液比、超聲時(shí)間、堿溶pH進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析法，確定DFA的最佳提取條件，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for extraction conditions optimization

將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得DFA得率對(duì)固液比（A）、pH（B）、超聲時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=6.36+0.55A+0.17B+0.11C+0.08AB-0.035AC-0.025BC-

0.62 A2-0.41B2-0.28C2

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

由表4可知，模型F值為70.33，P＜0.000 1，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。失擬項(xiàng)P=6.34＞0.05，表示失擬不顯著，模型的確定系數(shù)R2=0.989 1，說(shuō)明該模型能解釋98.91%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度比較好，可以用此模型對(duì)DFA提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由回歸模型和方差分析可知，方程一次項(xiàng)A、B、方程二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)DFA得率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；方程一次項(xiàng)C對(duì)DFA得率的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)DFA得率的影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可知，各個(gè)因素對(duì)DFA得率影響的大小順序?yàn)閇28-30]：固液比（A）＞pH值（B）＞超聲時(shí)間（C）。

2.4.2 響應(yīng)面直觀分析

響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖6，圖上能比較直觀和形象的看出最佳因素參數(shù)及各因素之間的交互作用[28，32]。3個(gè)響應(yīng)面圖均為開(kāi)口向下的凹形曲面，相應(yīng)的等高線圖呈明顯的橢圓形，說(shuō)明兩因素之間交互作用顯著（P＜0.01）[29-33]；且響應(yīng)面圖開(kāi)口向下，說(shuō)明響應(yīng)值（DFA得率）在其范圍內(nèi)存在最大值。

根據(jù)回歸方程求得固液比、pH、超聲時(shí)間分別取1∶8.38（g∶mL）、11.17、32.42 min時(shí)，可得理論上的最大DFA得率為6.51%。結(jié)合實(shí)際操作條件，修正固液比為1∶8.4（g∶mL）、pH值為11.2、超聲時(shí)間為32 min，3次重復(fù)得DFA實(shí)際得率為6.29%。由此可見(jiàn)，實(shí)際與理論值的相對(duì)誤差為0.03%，真實(shí)值與回歸方程的預(yù)測(cè)值偏差表明響應(yīng)面優(yōu)化對(duì)DFA進(jìn)行提取的研究是合理可行的。

圖6 固液比、pH和超聲時(shí)間交互作用對(duì)富里酸得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid and liquid ratio,pH and ultrasonic time on fulvic acid yield

3 結(jié)論

FA具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜易變等特點(diǎn)，一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，目前研究中的FA大多來(lái)自風(fēng)化煤、化學(xué)合成、生化發(fā)酵或湖、海等地的沉積泥物中[18，24]，F(xiàn)A根據(jù)其原料的不同自身特性也大不相同。本文根據(jù)腐殖質(zhì)的形成特性與白酒糟自身特點(diǎn)之間的某些相關(guān)聯(lián)系，選擇從白酒糟中提取DFA并研究其特性。不同狀態(tài)的白酒糟中DFA的含量差異較大，選擇用新鮮的白酒糟直接打漿提取DFA，即節(jié)省干燥成本又降低了DFA的損失。利用超聲波輔助響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，得最佳提取工藝為固液比1∶8.4（g∶mL），pH值11.2，超聲時(shí)間32 min，超聲功率360 W，超聲溫度45℃，DFA得率達(dá)到6.29%。為DFA的深入研究提供一定的技術(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。

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Optimization of extraction technology of fulvic acid in distillers grains by response surface method

RUI Wenjun,ZHAO Ping*,QIU Yue,YANG Heng,LIU Jintao,WANG Huan,ZHANG Yi
(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

According to the correlation between the formation of humus and distillers grains,using distillers grains as raw materials,fulvic acid was extracted from distillers grains.Compared with the content of the fulvic acid in dried and fresh distillers grains,the fulvic acid yield by water bath extraction and ultrasonic extraction methods were compared,and then the extraction method was determined.The fulvic acid extraction conditions were determined by single factor experiments and response surface experiments.Results showed that the fulvic acid contents in the fresh distillers grains was higher than that of the dry distillers grains,and ultrasonic assisted wethod was better than water bath extraction;the optimum extraction conditions were solid-liquid ratio 1∶8.4(g∶ml),pH11.2,ultrasonic time 32 min,power 360 W,temperature 45 ℃,and the yield of fulvic acid was 6.29%.

distillers grains;fulvic acid;response surface method;ultrasonic assisted;extraction process

TS209

0254-5071（2017）09-0082-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.018

2017-03-31

甘肅省高等學(xué)校科研項(xiàng)目（2014A-030）

芮文君（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與副產(chǎn)物綜合利用。

*通訊作者：趙 萍（1964-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)、農(nóng)產(chǎn)品加工與副產(chǎn)物綜合利用方面。