黃 結(jié)，覃 思

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

白砂糖中出芽短梗霉的鑒定及溯源

黃 結(jié)，覃 思

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

在制糖干燥包裝車間中找到白砂糖出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）的污染來源，建立白砂糖污染微生物的溯源方法。采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)結(jié)合的溯源方法，在制糖干燥包裝車間的生產(chǎn)線上進行樣品污染菌出芽短梗霉的溯源。在車間的白砂糖、通風(fēng)口空氣、排風(fēng)口空氣、鼓風(fēng)機表面、干燥機表面等均分離出出芽短梗霉，這幾株菌的特異性DNA序列和蛋白質(zhì)指紋圖譜相似度極高。白砂糖與車間環(huán)境之間存在交叉污染，需加強該車間的清潔及消毒滅菌工作，需在該車間的通風(fēng)口和排放口配置高效過濾網(wǎng)。構(gòu)建以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、PCR技術(shù)和MALDI-TOF MS技術(shù)結(jié)合的白砂糖微生物溯源方法，為制糖企業(yè)有針對性地采取有效控制措施提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

白砂糖；出芽短梗霉；PCR；MALDI-TOF MS；溯源

白砂糖的制糖工序是一種比較復(fù)雜的過程，其中蒸發(fā)、煮糖、分蜜和干燥等工序使微生物處于高溫或高滲透壓的條件下，多數(shù)微生物在其中難以生長繁殖。因此，白砂糖相比于其他加工食品，受微生物污染的數(shù)量較低，但在近幾年的國家監(jiān)督抽檢結(jié)果報道中，也常報道有白砂糖微生物項目（菌落總數(shù)[1]、酵母菌[2]）不合格情況，而且白砂糖是直接食用或作為其他食品加工原料，因此白砂糖的衛(wèi)生安全尤為重要。

微生物溯源是通過采用某些微生物分析技術(shù)把樣品與可疑污染源中的微生物比較出差異或有無生物標(biāo)記來判斷兩者之間存在的聯(lián)系，從而確定樣品可能的污染來源[3-4]。HAGEDORN C等[5]用抗生素抗性分析技術(shù)對Viriginia流域的糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）進行溯源，研究結(jié)果確認其主要污染來源為牛糞，然后采取限制牛接近水體的辦法，使該流域的糞大腸菌群數(shù)量減少了94%。陳曉[6]利用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)研究雙匯肘花和蒜蓉烤腸中腐敗菌（枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis））的污染源，結(jié)果表明，在其配料淀粉、大豆蛋白、白砂糖以及其生產(chǎn)線上的灌腸機、熟區(qū)用的剪刀和二次滅菌后產(chǎn)品中均能檢出該腐敗菌，即進行了成功溯源。然而，溯源方法至今在食糖污染上應(yīng)用較少。

目前，微生物溯源分型方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準，且各方法均存在有不同的局限性[7]。重復(fù)序列PCR（Rep-PCR）分型技術(shù)和脈沖場凝膠電泳脈沖場電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型技術(shù)早已被廣泛應(yīng)用于微生物溯源，但其操作復(fù)雜、耗時耗力、費用高。而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization timeofflightmass spectrometry，MALDI-TOFMS）分型技術(shù)相比PFGE分型技術(shù)，則具有操作簡單、快速、高通量、成本低[8]等優(yōu)點，但其存在質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫不足的缺陷[9]。MALDITOF MS技術(shù)是根據(jù)特異性指紋圖譜分析獨特的蛋白質(zhì)圖譜聚類分析對比分型，在食品微生物分型溯源方面已廣泛應(yīng)用[10]。鄭秋月等[11]利用MALDI-TOF MS技術(shù)對74株食源性致病菌沙門氏菌（Salmonellasp.）進行鑒定研究，結(jié)果表明，MALDI-TOFMS技術(shù)可用作沙門氏菌檢測和溯源分析。FIRACATIVE C等[12]利用MALDI-TOF MS技術(shù)在先建立新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）/格特隱球菌（Cryptococcus gattii）的8個基因型的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，再進行164株臨床菌株的檢測，結(jié)果表明，MALDI-TOFMS技術(shù)可將其微生物鑒定到種，準確率達100%。本研究構(gòu)建以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、PCR技術(shù)和MALDI-TOF MS技術(shù)結(jié)合的白砂糖微生物溯源方法，使企業(yè)能快速、準確地初步判斷白砂糖的污染來源，為企業(yè)有針對性地采取有效控制措施提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在我國華南地區(qū)的一個制糖企業(yè)的制糖干燥包裝車間中設(shè)置編號為1～22#的采樣點。其中1#為四級振篩干燥機上的白砂糖樣品；2～5#為車間各入門處的空氣沉降菌采樣；6～14#為車間各通風(fēng)口的空氣沉降菌采樣；15～22#為車間儀器設(shè)備表面微生物的采樣，各采樣點的位置見圖1所示。白砂糖的樣品采用滅菌的小鏟和三角瓶采集，低溫保存。空氣微生物采用空氣沉降菌法采集，平皿沉降30 min收皿，低溫保存。表面微生物采用滅菌棉簽浸無菌生理鹽水4支共涂抹100cm2的面積，裝入10 mL無菌生理鹽水的試管，低溫保存。一起帶回，在24h內(nèi)進行微生物的檢測和培養(yǎng)。

圖1 樣品采集位置示意圖Fig.1 Sketch map showing sampling locations

沙氏葡萄糖瓊脂（sabourauddextroseagar，SDA）培養(yǎng)基：北京三藥科技開發(fā)公司；PCR引物、酵母菌DNA提取試劑盒（Dr.GenTLE High Recovery）：大連TaKaRa公司；瓊脂糖：香港基因有限公司；GelRed染色液：美國Biotium公司；MALDI-TOF MS基質(zhì)、乙腈、三氟乙酸（色譜純）、標(biāo)準肽蛋白：德國Bruker Daltonik Gm bH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ESCO生物安全柜：新加坡ESCO公司；OLYMPUSBX51顯微鏡：奧林巴斯公司；BD（E2）240電熱恒溫培養(yǎng)箱：德國Binder公司；Mastercyler gradient PCR儀：Eppendorf（中國）有限公司；UNIVERSAL320R高速冷凍離心機：德國Hettich公司；BIO-RAD電泳槽、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)：美國伯樂公司；MALDI-TOFMS基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜儀：德國Bruker Daltonik Gm bH公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測分離純化

在車間采集的空氣沉降菌按照GB 16292—2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子測試方法》采集檢測，表面微生物按照《中國藥典》四部9205擦拭法采集，采集的白砂糖和表面微生物樣品按照GB4789—2010《食品微生物檢驗標(biāo)準進行菌落總數(shù)與霉菌和酵母計數(shù)》的檢測。平皿上生長的菌落進行分離純化后，分別劃線于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面4℃保藏。

1.3.2 PCR技術(shù)鑒定

引物：根據(jù)待測菌株的顯微觀察結(jié)果，以酵母菌的26S rRNA基因D1/D2為保守區(qū)，選用酵母菌通用引物D1和D2。上游引物D1：5′-GCAT ATCA ATAA GCGG AGGA AAAC-3′；下游引物D2：5′-GGTC CGTG TTTC AAGA CGG-3′。

DNA提?。河脽o菌接種環(huán)挑取3～5個純菌落在裝有超純水的專用試管中磨散，制成0.5麥氏單位的菌懸液（1×108CFU/mL），然后嚴格按照酵母菌DNA提取試劑盒的步驟進行DNA的提取。

PCR擴增：以提取好的DNA為模板，用對應(yīng)的引物進行PCR擴增。PCR擴增采用50μL體系：DNA模板3μL，上游引物0.5 μL（20 pmol/μL），下游引物0.5 μL（20 pmol/μL），預(yù)混酶25 μL，雙蒸水21 μL。擴增條件：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，30個循環(huán)；72 ℃、5 min。

電泳檢測：采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，瓊脂糖凝膠為1.0%，溴化乙錠1μL，PCR擴增產(chǎn)物上樣量為5μL，6×LoadingBuffer 1 μL，DNA Marker 5 μL，電泳電壓100 V，電流80 mA，電泳時間約45 min。

1.3.3 MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定

MALDI-TOF MS技術(shù)是利用微生物具有特異性保守核糖體蛋白的原理進行對微生物的鑒定。用一次性接種針挑取少許純菌落輕輕涂抹于MALDI靶板的靶點上，涂成一個薄層，然后在薄層上滴加1 μL 70%甲酸水溶液，室溫下晾干，再滴加1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液，室溫晾干，樣品和基質(zhì)結(jié)合形成一薄層淡黃色晶體，立即可放入MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進行菌株鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果及分離純化

為找出白砂糖中檢出微生物與環(huán)境檢出微生物之間存在的相關(guān)性，在我國華南地區(qū)的一個制糖干燥包裝車間中設(shè)置了白砂糖樣品、空氣沉降菌、設(shè)備表面微生物等采樣點，共計22個，在這22個采樣點上分別檢測得到的細菌總數(shù)和霉菌、酵母菌總數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 各取樣點的菌落數(shù)Table 1 Total plate count of sampling point

由表1可知，在制糖干燥包裝車間中真菌的污染比較嚴重，尤其是在20和21號的采樣點檢測到的真菌數(shù)最多。

用一次性接種環(huán)挑取檢測到的菌株，經(jīng)過分離純化，在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA平板28℃分離培養(yǎng)后，得出采樣點1、7、11、14和20#均有一種相似真菌，結(jié)果見圖2。

圖2 分離菌株的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)Fig.2 Colonies and morphology of isolated strains

由圖2可知，在培養(yǎng)2 d的SDA平板上生長的菌落為乳白色中間帶少許褐色，在培養(yǎng)5 d后菌落成灰色，周圍產(chǎn)生黑色素。在水浸制片16×40倍顯微鏡下為橢圓形細胞的酵母菌形態(tài)。

2.2 PCR技術(shù)鑒定

按照顯微形態(tài)觀察結(jié)果，用酵母菌DNA提取試劑盒，對2.1分離得到的采樣點（1、7、11、14、20）的這種相似真菌分別進行DNA的提取。用酵母菌的特異性引物擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果見圖3。

圖3 分離菌株的凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoretogram of isolated strains

由圖3可知，1、7、11、14和20#采樣點分離的菌株在555bp處均有擴增，而且陽性對照有擴增，陰性對照沒有擴增。表明使用的引物特異性強，使用的酵母菌DNA提取方法、酵母菌PCR反應(yīng)體系、酵母菌PCR反應(yīng)條件等實驗合適，結(jié)果滿意、可靠。

采用MEGA5.05生物學(xué)軟件將GenBank基因庫中搜索分析得到的相似序列結(jié)果進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，得到系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of isolated strains

由圖4可知，菌株1Y、7K、11K、14K、20B與Aureobasidium pullulansAY213639.1、AureobasidiumpullulansFJ515165.1、Aureobasidium pullulansKC253968.1同處于最小分支，表明以上菌株具有極高相似度的DNA序列片段，鑒定出菌株1Y、7K、11K、14K、20B為出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）。

2.3 MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定

采用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀鑒定1、7、11、14和20號分離的菌株，以蛋白質(zhì)離子質(zhì)荷比（m/z）在2 000～20 000為橫坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)離子峰為縱坐標(biāo)，列出各菌株的蛋白質(zhì)指紋圖譜，結(jié)果見圖5。

圖5 分離菌株的蛋白指紋圖譜Fig.5 Protein fingerprint of isolated strains

由圖5可知，菌株1Y、7K、11K、14K、20B的主要蛋白質(zhì)組成基本相同，且與蛋白譜庫中出芽短梗霉的蛋白圖譜吻合，說明采樣點1、7、11、14和20號存在相似度極高的出芽短梗霉。

2.4 討論

本研究以PCR技術(shù)鑒定出芽短梗霉，采用酵母菌DNA的提取方法、酵母菌特異性引物、酵母菌PCR反應(yīng)體系、酵母菌PCR反應(yīng)條件等，實驗結(jié)果表明實驗條件選擇正確，鑒定結(jié)果準確可靠。出芽短梗霉的鑒定可采用與酵母菌相同的處理方法[13-14]。

在對車間白砂糖和環(huán)境進行微生物檢測時發(fā)現(xiàn)，其受真菌污染比較嚴重，特別是車間的窗戶和通風(fēng)口處，見圖1和表1的20#和21#，霉菌、酵母菌總數(shù)分別為2.8×103CFU/g和2.6×102CFU/g，很可能的污染原因是窗戶和通風(fēng)口沒安過濾網(wǎng)，使得車間外部不潔凈空氣進來，易污染了車間環(huán)境和車間樣品。因此，建議加強車間的清潔及消毒滅菌工作，把紫外燈消毒換為臭氧發(fā)生器滅菌，因為臭氧殺滅真菌的效果比紫外線照射效果好[15]；建議車間配置上溫濕度控制系統(tǒng)，降低車間濕度，不易真菌生長；建議在車間的各送風(fēng)口、通風(fēng)口和窗戶等裝上高效過濾網(wǎng)，以有效去除空氣中微生物和塵埃。這樣可能會大大降低產(chǎn)品受微生物污染的程度。

3 結(jié)論

本研究以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、PCR技術(shù)和MALDI-TOF MS技術(shù)結(jié)合的溯源方法，對白砂糖檢出的出芽短梗霉在制糖干燥包裝車間中進行溯源。結(jié)果表明，四級振篩干燥機上的1#白砂糖，車間7#通風(fēng)口、11#鼓風(fēng)機口、14#通風(fēng)口的空氣沉降菌，20#窗戶表面微生物均有出芽短梗霉檢出，并且它們之間具有相一致的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)、相似度高的特異性DNA序列和相同的特異性蛋白質(zhì)組成。對污染白砂糖的出芽短梗霉進行了成功溯源，為制糖企業(yè)有針對性地采取有效控制措施提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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Identification and tracing ofAureobasidium pullulansin white granulated sugar

HUANG Jie,QIN Si
(Guangxi Institute for Food and Drug Control,Nanning 530021,China)

The pollution source ofAureobasidium pullulansin white granulated sugar was found out in the dry packing workshop,and a tracing method of microorganism causing white granulated sugar pollution was established.Combining with traditional morphology,PCR technique and MALDI-TOFMS technique,the tracing ofA.pullulanson samples was conducted to the production line of dry packing workshop of sugar refinery.A.pullulanswas screened from the white granulated sugar in workshop,ventilation opening air,exhaust outlet air,surface of air blower and surface of drying machine,etc.The similarity of specific DNA sequence and protein finger-print of these strains was extremely high.There was cross contamination between white granulated sugar and workshop environment,so it needs to strengthen the cleaning and sterilization of the workshop.In addition,hepa filter should be set in the ventilation opening and discharge outlet of the workshop.In this paper,the microorganism tracing method of white granulated sugar combined with traditional morphology,PCR technique and MALDI-TOFMS technique was established,to provide experimental foundation and theoretical basis for taking effective control measures of sugar enterprises.

white granulated sugar;Aureobasidium pullulans;PCR;MALDI-TOF MS;tracing

TS207.3

0254-5071（2017）09-0078-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.017

2017-03-29

廣西食品藥品檢驗所科研項目（KY201509）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（桂科重14122003-6）

黃 結(jié)（1978-），女，微生物檢驗技術(shù)中級，碩士，研究方向為化妝品、食品、藥品等微生物學(xué)檢驗。