李永博，鄧 波，劉燕梅，黃治國，2*

（1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；4.宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川 宜賓 644002）

基于PLFA分析不同窖齡窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)

李永博1，鄧 波3，劉燕梅4，黃治國1，2*

（1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；4.宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川 宜賓 644002）

該試驗采用磷脂脂肪酸（PLFA）生物標記法對兩種不同窖齡窖泥（30年、100年）微生物群落特征進行了研究。結(jié)果表明，100年窖齡窖泥微生物群落多樣性高于30年的。對兩種不同窖齡窖泥各類型的微生物結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，100年窖齡窖泥各類型的微生物含量均高于30年窖齡窖泥的，并且在兩種不同窖齡窖泥中細菌的含量與豐度較其他類型微生物高，表明細菌是窖泥優(yōu)勢菌群。對兩種不同窖齡窖泥磷脂脂肪酸含量進行主成分分析發(fā)現(xiàn)，30年窖齡窖泥的主要變異菌群是細菌，100年窖齡窖泥的主要變異菌群是細菌與真菌。

濃香型白酒；窖泥；微生物群落結(jié)構(gòu)；磷脂脂肪酸

窖泥是濃香型白酒功能菌生長繁殖的載體，它直接影響著白酒中香味物質(zhì)的生成，而且在發(fā)酵過程中賦予了濃香型白酒獨特的芳香物質(zhì)[1-3]。生產(chǎn)實踐經(jīng)驗表明，窖池窖齡與釀酒質(zhì)量有著緊密聯(lián)系，只有老窖才能出好酒[4-5]?；煺衾m(xù)糟、不間斷發(fā)酵使窖泥長期處在高乙醇含量、低pH、微氧環(huán)境中，從而形成了獨特的微生物群落[6]。因而解析窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)對濃香型白酒的生產(chǎn)有著重要的指導意義。

近年來，隨著對窖池微生物群落研究的深入涌現(xiàn)出許多對窖池微生物群落研究的新方法[7-9]。羅惠波等[10-11]分別利用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（polymerasechainreactionsingle strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerasechainreactiondenaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)對窖池的微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究，試圖揭示其群落特征。但因受引物的特異性、DNA提取條件以及窖池微生物群落的復雜性，目前還很難對其微生物群落結(jié)構(gòu)進行全面地描述[5]。

磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）是活體微生物細胞膜的重要組成成分，不同類群的微生物有著不同的生化途徑來合成不同的PLFA，同類群微生物的PLFA具有高度的特異性[12-13]，因此可以通過監(jiān)測特征磷脂脂肪酸的組成和數(shù)量變化來揭示微生態(tài)環(huán)境中微生物群落的組成及變化規(guī)律，目前該方法已廣泛的應(yīng)用于土壤等環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析[14-15]。鄧杰等[16]對濃香型白酒不同窖齡窖池窖泥中的古菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，100年窖齡窖池微生物群落相似性較高，30年窖齡窖池微生物群落差異性較大；陶勇等[4]對窖泥細菌群落結(jié)構(gòu)研究表明，50年窖泥樣品微生物多樣性低于10年窖泥樣品。本研究采用磷脂脂肪酸分析技術(shù)，對不同窖齡窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析，以期獲得窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)及生物量信息，從而為更好地認識濃香型白酒窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)奠定一定的理論基礎(chǔ)，同時也為實時監(jiān)測窖池微生物群落結(jié)構(gòu)變化提供一種研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30年窖齡、100年窖齡窖泥：采自瀘州老窖股份有限公司白酒生產(chǎn)窖池（瀘州地區(qū)），于窖壁上層（距窖口50 cm）、中層（距窖底50 cm）和下層（窖池底部）分別取樣，迅速置于冰盒運回，4℃保藏，24 h內(nèi)完成預(yù)處理。

K2HPO4、CHCl3、甲苯、醋酸、KOH（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純）：德國Darmstadt公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XMTD型水浴鍋：余姚長豐儀器廠；ZHWY-103D型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；GC6890型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、SampliqSilica硅膠萃取小柱：美國Agilent科技有限公司；Sherlock 6.0微生物鑒定系統(tǒng)：美國MIDI公司；BF2000型氮氣吹干儀：北京八方世紀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PLFA的提取

稱取8g窖泥樣品置于50mL離心管中，加入5mL50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）、6 mL三氯甲烷和12 mL甲醇，并加入5 μL 2.5 mmol/L 1,2-二?；?sn-甘油-3-磷酰膽堿作為內(nèi)標，振蕩2 h，室溫條件下3 500 r/min離心10 min。取上清液于分液漏斗，將沉淀加入5 mL磷酸緩沖液，6 mL三氯甲烷，12 mL甲醇，振蕩30 min，室溫條件下3 500 r/min離心10 min，將上清液與之前的上清液合并，加入分液漏斗后，加入12 mL三氯甲烷，12 mL磷酸緩沖液，振蕩2 min，過夜靜置分層，取下層溶液于試管中，32℃水浴，N2濃縮吹干，加入5份200 μL三氯甲烷溶解總脂肪酸后轉(zhuǎn)移到硅膠萃取小柱中，分別加入5 mL氯仿、5 mL丙酮（2次）清洗小柱后，加入5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管中，32℃水浴，N2濃縮吹干即得到磷脂脂肪酸。

1.3.2 PLFA甲基化

將磷脂脂肪酸溶于1 mL甲苯與甲醇的混合液（V/V，1∶1），加入1mL0.2mmol/L氫氧化鉀，搖勻，37℃水浴15min，加入0.3mL1mmol/L醋酸溶液，再加入2mL己烷，2mL超純水，低速振蕩10 min，將萃取得到上層清液于玻璃試管中，再加2mL己烷重復萃取1次，取上清液合并到剛才試管中N2濃縮吹干即得到甲基化的磷脂脂肪酸，4℃條件下保存待測。

1.3.3 PLFA氣相色譜分析

將所得的磷脂脂肪酸樣品用600 μL的己烷溶解，進行氣相色譜分析。氣相色譜儀配備分流進樣口、氫火焰離子檢測器（flameionizationdetector，F(xiàn)ID）及Agilent氣相色譜化學工作站。色譜條件：Ultra-2色譜柱（25mm×0.2mm×0.33μm）；程序升溫：起始溫度170℃，5℃/min升至260℃，隨后40℃/min升至310℃，維持1.5 min；進樣口溫度250℃，載氣為氫氣，流速0.5mL/min，分流進樣模式，分流比100∶1，進樣量2 μL；氫火焰離子檢測器溫度300℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速216 mL/min，氮氣（N2）流速30 mL/min。

1.3.4 PLFA微生物群落的表征

通過對PLFA圖譜中不同磷脂脂肪酸種類及其含量的分析，可以對樣品的微生物種類及生物量進行分析。磷脂脂肪酸為i13：0、a14：0、i15：0、a15：0、a16：0和i16：0代表革蘭氏陽性菌（G+）；磷脂脂肪酸為16：1ω5、16：1ω7、16：1ω9、cy17：0和18：1ω6代表革蘭氏陰性菌（G-）；磷脂脂肪酸為18：2ω6，9、18：1ω9代表真菌；磷脂脂肪酸為cy17：0、cy19：0代表厭氧菌；磷脂脂肪酸15：0、i16：0、i17：0代表好氧細菌；磷脂脂肪酸10Me18：0代表放線菌[17-18]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

磷脂脂肪酸（PLFA）的鑒定和分析采用美國MIDI公司開發(fā)的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定的SherlockMIS4.5系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同窖齡窖泥微生物的PLFA組分分析

對兩種不同窖齡窖泥中磷脂脂肪酸含量進行檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 兩種窖齡窖泥磷脂脂肪酸含量檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of phospholipid fatty acid contents in pit mud with two kinds of pit ages

由圖1可知，100年窖齡窖泥中共檢測到32中脂肪酸，其中直鏈脂肪酸8種，支鏈脂肪酸11種，環(huán)狀脂肪酸2種，單不飽和脂肪酸6種，多不飽和脂肪酸5種；30年窖齡窖泥中共檢測到22種脂肪酸，包括直鏈脂肪酸6種，支鏈脂肪酸8種，環(huán)狀脂肪酸1種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸4種。并且在100年窖齡窖泥中還檢測到i13：0、a13：0、15：1ω6、15：4ω3、16：1ω9、16：2DMA、16：1ω7DMA、10Me16：0、cy17：0ω7、i18：0、18：2DMA、20：2ω6脂肪酸組分，表明100年窖齡窖泥中微生物的生物多樣性高于30年的。這可能是由于隨著窖齡的增長，窖池中的微生物菌群種類逐漸豐富并趨于穩(wěn)定，使100年窖齡窖泥中微生物的生物多樣性高于30年的。

2.2 不同窖齡窖泥中各類型微生物含量分析

表1 不同窖齡窖泥中各類型微生物含量Table 1 Contents of each type microbes in pit mud with different pit ages

由表1可知，100年窖齡窖泥中代表菌株革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、放線菌、厭氧菌含量均高于30年窖齡窖泥。這可能是由于濃香型白酒采用混蒸續(xù)糟、不間斷發(fā)酵生產(chǎn)工藝，使得生產(chǎn)過程中投入的發(fā)酵原料等同于向窖池微生態(tài)系統(tǒng)中輸入碳、氮、磷、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)。隨著窖池使用時間的延長，大大提高了窖池窖泥中有機質(zhì)的含量，改善了窖池的營養(yǎng)狀況，使棲息在窖池中的功能微生物能夠更好地生長繁殖。并且革蘭氏陽性菌在兩種不同窖齡窖泥中含量最高，表明革蘭氏陽性菌為窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢菌群。這可能是由于革蘭氏陽性菌對于惡劣的環(huán)境具有較好的抵抗力，因此在高酸、低氧的條件下，革蘭氏陽性菌的生長情況較其他菌群好。

2.3 不同窖齡窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)特征分析

圖2 不同窖齡窖泥中各類型微生物百分含量Fig.2 Percent contents of each type microbes in pit mud with different pit ages

由圖2可知，100年窖齡窖泥中革蘭氏陰性菌、厭氧菌的百分含量高于30年窖齡窖泥中的，而革蘭氏陽性菌、真菌、放線菌的百分含量低于30年窖齡窖泥的。這可能是由于窖池在發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生的有機酸和醇類等物質(zhì)在滴窖過程中隨黃水下滲至窖池底部，形成了高酸度、高乙醇及微氧的環(huán)境，使得窖池這種特殊的微環(huán)境對微生物進行了選擇，那些不適合在高乙醇含量、低pH、微氧環(huán)境下生長的菌種被逐漸淘汰，而適合在這種極端環(huán)境下生長的微生物被不斷的富集豐富。

2.4 不同窖齡窖泥不同位置中微生物群落結(jié)構(gòu)特征分析

圖3 不同窖齡不同位置各類型微生物百分含量Fig.3 Percent contents of each type microbes in pit mud with different pit ages and different positions

圖4 30年（A）和100年（B）窖齡不同位置各類型微生物含量Fig.4 Content of each type microbes in different positions of 30 years old(A)and 100 years old(B)pit mud

由圖3、圖4可知，在30年窖齡窖池中，隨著窖池由上至下，G-菌、厭氧菌、放線菌的百分含量與含量呈現(xiàn)先升后降趨勢，真菌的百分含量與含量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，而G+菌的百分含量與含量呈現(xiàn)先降后升趨勢并在底部達最大；在100年窖齡窖池中，隨著窖池由上至下，G+菌、G-菌、真菌的百分含量呈現(xiàn)下降的趨勢，其含量呈現(xiàn)先降后升趨勢，厭氧菌、放線菌的百分含量與含量呈現(xiàn)上升的趨勢，并且窖池底部的各類型微生物含量都較其他位置高。這可能是由于窖池在長期發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生了大量的有機酸、腐殖質(zhì)、菌體自溶物、礦物質(zhì)等，它們隨黃水下滲到窖池底部，使窖池底部營養(yǎng)物質(zhì)較其他部位多，微生物能夠更好地生長繁殖，加上不同位置的窖泥其含氧量不同，受氧脅迫存在差異，并且外部環(huán)境對不同位置的影響也不同，故導致了不同位置窖泥微生物群落的差異性。

2.5 不同窖齡窖池PLFA主成分分析

圖5 30年（A）和100年（B）窖齡窖泥磷脂脂肪酸主成分分析Fig.5 PCA of PLFA in different positions of 30 years old(A)and 100 years old(B)pit mud

由圖5可知，不同窖齡窖泥中PLFA可分為2種類型，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）。PC1對30年與100年窖齡窖池微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)組成的貢獻率分別為77.26%和67.91%，能夠較好地反映數(shù)據(jù)所代表的信息，故用PC1來反映不同窖齡窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)的變異。由圖5A可知，PC1主要集中了表征細菌PLFA組分a14：0、i15：0、15：0、i16：0、i17：0，表明細菌是30年窖齡窖池主要變異菌群；由圖5B可知，PC1主要集中了表征細菌與真菌PLFA組分a15：0、15：0、16：1ω9、16：1ω7、i17：1ω9、18：2ω6、18：1ω9，表明細菌與真菌是100年窖齡窖池主要變異菌群。由各PLFA在PC1上的載荷值可知，a14：0、i15：0、a15：0、18：2ω6、18：1ω9的載荷值隨著窖齡的增加而減少，表明革蘭氏陽性菌與真菌對群落結(jié)構(gòu)的影響減少；16：1ω9、16：1ω7、10Me18：0的載荷值隨著窖齡的增加而增加，表明革蘭氏陰性菌與放線菌對群落結(jié)構(gòu)的影響在增加。

3 結(jié)論

窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)對白酒的香味和品質(zhì)有著重要的影響，本試驗通過對兩種不同窖齡窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100年窖齡窖泥中微生物多樣性比30年的豐富，100年窖齡窖泥各類型的微生物含量高于30年窖齡窖泥的，而且細菌在兩種不同窖齡窖泥中的含量與豐度較其他類型微生物高?；赑LFA組成的主成分分析結(jié)果，表明30年窖齡窖池主要變異菌群為細菌，100年窖齡窖池主要變異菌群為細菌與真菌。隨著窖齡的增加，革蘭氏陽性菌與真菌對群落結(jié)構(gòu)的影響減少，革蘭氏陰性菌與放線菌對群落結(jié)構(gòu)的影響在增加。從而為全面了解窖泥微生物區(qū)系分布及主要功能微生物奠定了一定的基礎(chǔ)，也為老窖環(huán)境的人工模擬及條件控制提供理論依據(jù)。

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Analysis of microbial community structure in pit mud with different pit ages based on PLFA

LI Yongbo1,DENG Bo3,LIU Yanmei4,HUANG Zhiguo1,2*
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China;2.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China;3.Luzhou Laojiao Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;4.Yibin Product Quality Supervision and Inspection Institute,Yibin 644002,China）

The microbial communitycharacteristics of two kinds of pit mud with different pit ages(30 years,100 years)were researched by phospholipid fattyacid(PLFA)biomarkermethod.Theresultsshowedthatthemicrobialcommunitydiversityinthe100yearsoldpitmudwashigherthanthatin30years,the each type microbes contents in 100 years old mud pit was more than that in 30 years.The contents and abundances of bacteria in two kinds of pit mud were higher than others types microbe,which indicated that bacteria was the dominant microbe in the pit mud.The results of phospholipid fatty acid contents analysis of two pit mud indicated that the main varied microbial community in 30 years old pit mud was bacteria,and in 100 years old pit mud was bacteria and fungi.

Luzhou flavorBaijiu;pit mud;microbial community structure;phospholipid fatty acid

TS262.3

0254-5071（2017）09-0074-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.016

2017-03-20

國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心開放課題（2015K-246）；固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室開放基金項目（2015GTY004）；四川理工學院瀘州老窖科研獎學金項目（13ljzk03）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201210622014）

李永博（1992-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：黃治國（1978-），男，博士，教授，研究方向為發(fā)酵工程。