吳軒德，李 洲，周世水*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東金牌生物科技股份有限公司，廣東 陸豐 516600）

二步法釀造β-苯乙醇調(diào)味酒的工藝優(yōu)化

吳軒德1，李 洲2，周世水1*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東金牌生物科技股份有限公司，廣東 陸豐 516600）

在釀酒酵母轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成β-苯乙醇的基礎(chǔ)上，通過紫外誘變育種、好氧發(fā)酵與補料厭氧發(fā)酵的二步法工藝來研制β-苯乙醇調(diào)味酒。以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GIM2.35為出發(fā)菌種，進行兩輪紫外誘變，篩選獲得1株較初始菌株合成β-苯乙醇能力提高了13.6%的誘變菌株UV-15-15；通過單因素試驗，獲得好氧發(fā)酵優(yōu)化工藝條件為麥芽汁11°P，L-苯丙氨酸5 g/L，發(fā)酵24 h，此時β-苯乙醇質(zhì)量濃度為1.69 g/L，較優(yōu)化前提高了6.3%；補料厭氧發(fā)酵工藝優(yōu)化條件為補料比例1∶4，補料液L-苯丙氨酸含量5 g/L，巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）接種量3%（V/V），發(fā)酵8 d，酒精度11.2%vol，乙酸含量0.37 g/L，β-苯乙醇質(zhì)量濃度為1.17 g/L，蒸餾酒感官評分為8.9分。

β-苯乙醇；釀酒酵母；二步法工藝

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，按照主體的香氣組成，可分為濃香型、清香型、醬香型和米香型等香型，其中米香型白酒歷史悠久，含有乳酸乙酯、乙酸乙酯和β-苯乙醇三種主體香味物質(zhì)，特別是β-苯乙醇含量明顯高于其他香型白酒[1-2]。

β-苯乙醇是一種具有淡雅細膩玫瑰香味的芳香醇，玫瑰芳香氣味頗受人們歡迎。目前主要通過微生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)“天然”的β-苯乙醇[3]，能夠高效轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的微生物包括釀酒酵母[4]、異常漢遜酵母[5]等，研究人員通過誘變育種、基因工程育種等方法來提高菌種轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的能力[3]，如梅建鳳等[6]通過自然分離純化和紫外誘變，篩選獲得1株轉(zhuǎn)化合成β-苯乙醇濃度有顯著提高的釀酒酵母菌株，β-苯乙醇的濃度較原始菌株提高了10.2%，YIN S等[7]在釀酒酵母中共表達ARO8和ARO10基因，β-苯乙醇的產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了36.8%。從微生物轉(zhuǎn)化而來的β-苯乙醇被廣泛應(yīng)用到相關(guān)產(chǎn)品中[8]，特別是在米香型白酒的基礎(chǔ)上提高米酒β-苯乙醇含量來滿足不同消費者的需求，據(jù)報道，當前的調(diào)味酒主要以提高酯類（己酸乙酯、乙酸乙酯等）、酸類（戊酸、乙酸等）等為目標[9-11]，還未有針對β-苯乙醇調(diào)味酒的研究。

β-苯乙醇調(diào)味酒是酒體中β-苯乙醇含量較高，可用于增強白酒中β-苯乙醇香味的一種調(diào)味酒。本研究采用生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇，通過好氧發(fā)酵與補料厭氧發(fā)酵的二步法工藝來研究生產(chǎn)一種高β-苯乙醇含量的優(yōu)質(zhì)調(diào)味酒，為今后基酒勾兌出高品質(zhì)米香型白酒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GIM2.35：購自廣東省微生物菌種保藏中心；巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）：華南理工大學釀酒實驗室保存；β-苯乙醇（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸丁酯（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；L-苯丙氨酸（食品級）：河南瑞成生物科技有限公司；正己烷（分析純）：天津大茂化學試劑廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。

巴氏醋桿菌培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L、葡萄糖10 g/L，滅菌后加入3%（V/V）無水乙醇。

麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽經(jīng)糖化水解后制成麥芽汁，然后調(diào)整至所需濃度，并添加適量L-苯丙氨酸。

1.2 儀器與設(shè)備

YQ-PJ-6B型自動糖化器：輕工業(yè)部西安輕機所光電公司；UV-2700紫外可見分光光度計：日本島津公司；Agilent 7890A氣相色譜儀（配DB-WAX 122-7032毛細管柱）：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫外誘變方法

將釀酒酵母GIM2.35接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)14 h，取5 mL菌懸液于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中（內(nèi)放一個回形針），置于磁力攪拌器上，在超凈臺紫外燈（30 W，距離20 cm）下分別誘變[12]0、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min，用無菌水稀釋涂布YPD平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，測定波長254 nm處的吸光度值，計算致死率，繪制致死率曲線。

1.3.2 誘變選育菌種

按1.3.1的方法，挑取生長良好的菌落液體活化后，按5%（V/V）接種到11°P麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基（含L-苯丙氨酸5g/L），于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后測定β-苯乙醇含量，選出高產(chǎn)β-苯乙醇菌株進行第二輪紫外誘變選育。

1.3.3 誘變菌株的好氧發(fā)酵工藝優(yōu)化

添加了L-苯丙氨酸的麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基裝量50 mL（250 mL三角瓶），接種5%（V/V）酵母液，于30℃、200 r/min搖床發(fā)酵，以發(fā)酵液中β-苯乙醇產(chǎn)量為指標，分別進行麥芽汁濃度（3 °P、5 °P、7 °P、9 °P、11 °P、13 °P、15 °P、19 °P）、L-苯丙氨酸添加量（0、1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、11g/L）、發(fā)酵時間（18 h、21 h、24 h、27 h、30 h、33 h）的優(yōu)化實驗。

1.3.4 誘變菌株的厭氧發(fā)酵工藝優(yōu)化

以好氧發(fā)酵液為基礎(chǔ)，進行補料厭氧發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后按50%體積蒸餾。將β-苯乙醇產(chǎn)量、酒精度和感官評分作為評價指標，分別進行補料比例（1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8）、補料液L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度（0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L）、巴氏醋桿菌接種量（0、1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵時間（4d、6d、8d、10d）的優(yōu)化實驗。

1.3.5 測定方法

致死率計算公式如下：

式中：A為對照組1 mL菌液的吸光度值；B為試驗組1 mL菌液的吸光度值。

發(fā)酵液中還原糖含量[13]：二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）測定。

釀酒酵母的生物量：取發(fā)酵液5 mL于已稱質(zhì)量的離心管中，8 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌兩次后，105℃烘干至質(zhì)量恒定，測菌體干質(zhì)量[14]。

酒精度的測定：酒精計法。

L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率為β-苯乙醇轉(zhuǎn)化率=（β-苯乙醇質(zhì)量濃度×L-苯丙氨酸摩爾質(zhì)量）/（β-苯乙醇摩爾質(zhì)量×L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度）×100%。

β-苯乙醇的測定方法：好氧發(fā)酵參考文獻[15]的方法進行，繪制β-苯乙醇標準曲線（y=0.130 9x+0.005 5，R2=0.999 5）；厭氧發(fā)酵參考文獻[16-17]的方法進行，繪制β-苯乙醇標準曲線（y=1.254 5x-0.194 3，R2=0.999 1）和乙酸標準曲線（y=0.377 7x-0.072 7，R2=0.994 7）。

感官評分：由10人組成的品評小組對調(diào)味酒色、香、味品評綜合打分，滿分10分，評分標準見表1。

表1 調(diào)味酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of flavoring liquor

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變育種

2.1.1 紫外誘變的致死率曲線

按1.3.1的方法對釀酒酵母GIM2.35進行紫外誘變，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在誘變時間為8 min時，其致死率已達到90%，即可以使釀酒酵母基因產(chǎn)生足夠的突變，確定誘變時間為8 min。

以釀酒酵母GIM2.35為初始菌株，按1.3.2的方法進行兩輪誘變選育菌種，分別從兩輪紫外誘變平板中挑取50個單菌落進行發(fā)酵，測定發(fā)酵液中β-苯乙醇產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

圖1 菌株GIM2.35的誘變致死率曲線Fig.1 Mutagenic lethality curve of strain GIM2.35

表2 誘變菌株發(fā)酵液中β-苯乙醇測定結(jié)果Table 2 Test results of β-phenylethanol in fermentation liquor by mutation strain

由表2可知，第一輪誘變后獲得2株較高產(chǎn)β-苯乙醇菌株UV-12和UV-15，選其中的UV-15進行第二輪誘變，獲得誘變菌株UV-15-15，其β-苯乙醇產(chǎn)量比初始菌株提高了13.6%。

2.1.2 誘變菌株UV-15-15的穩(wěn)定性試驗

為了確定誘變菌株UV-15-15的遺傳穩(wěn)定性，對其進行連續(xù)10次的傳代發(fā)酵試驗，結(jié)果如圖2。

圖2 誘變菌株UV-15-15遺傳穩(wěn)定性實驗Fig.2 Genetic stability tests of mutation strain UV-15-15

由圖2可知，誘變菌株UV-15-15經(jīng)連續(xù)傳代后，其β-苯乙醇產(chǎn)量不僅沒有降低，反而略有提高，而且結(jié)果較穩(wěn)定?？梢姡贤庹T變選育高產(chǎn)β-苯乙醇釀酒酵母是可行的，且誘變效果良好和遺傳性能穩(wěn)定。

2.2 誘變菌株UV-15-15搖床發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 麥芽汁濃度對β-苯乙醇產(chǎn)量的影響

按1.3.3方法進行麥芽汁濃度的優(yōu)化試驗，結(jié)果見圖3。

圖3 麥芽汁濃度對轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的影響Fig.3 Effects of wort concentration on β-phenylethanol bioconversion

由圖3可知，當麥芽汁濃度在3～11°P時，隨著麥芽汁濃度的增加，β-苯乙醇產(chǎn)量逐漸增加，最高達1.70 g/L，當麥芽汁濃度＞11°P時，β-苯乙醇產(chǎn)量呈下降趨勢。這可能是在高糖環(huán)境中釀酒酵母代謝旺盛且合成了較多乙醇，從而對β-苯乙醇的合成產(chǎn)生抑制作用[18]。菌體干質(zhì)量和殘?zhí)呛侩S麥芽汁濃度的增加而增加，這表明誘變菌株UV-15-15對高濃度的麥芽汁耐受性較強。從β-苯乙醇產(chǎn)量和殘?zhí)强紤]，確定初始麥芽汁濃度為11°P。

2.2.2 L-苯丙氨酸濃度對β-苯乙醇產(chǎn)量的影響

按1.3.3方法進行L-苯丙氨酸濃度的優(yōu)化試驗，結(jié)果見圖4。

圖4 L-苯丙氨酸濃度對轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的影響Fig.4 Effects of L-phenylalanine concentration on β-phenylethanol production by bioconversion

由圖4可知，隨著添加L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度的增加，β-苯乙醇的產(chǎn)量顯著增加（P＜0.05），轉(zhuǎn)化率隨之降低，菌體干質(zhì)量先降低后趨于穩(wěn)定。當L-苯丙氨酸含量為5 g/L時，β-苯乙醇產(chǎn)量高達1.72 g/L，轉(zhuǎn)化率為46.6%；超過5 g/L時，β-苯乙醇產(chǎn)量增加緩慢，轉(zhuǎn)化率較低，而菌體干質(zhì)量趨于穩(wěn)定。因此，確定初始L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為5 g/L。

2.2.3 發(fā)酵時間對β-苯乙醇產(chǎn)量的影響

按1.3.3方法進行發(fā)酵時間的優(yōu)化試驗，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的影響Fig.5 Effects of fermentation time on β-phenylethanol bioconversion

由圖5可知，β-苯乙醇產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，菌體干質(zhì)量增加和還原糖含量下降不明顯。當搖床發(fā)酵24 h時，β-苯乙醇產(chǎn)量高達1.69 g/L，在24 h以后，其產(chǎn)量基本不再增加。因此，確定最佳發(fā)酵時間為24 h。雖然好氧發(fā)酵β-苯乙醇含量很高，但是酒體口感非?？啵瑹o法作為調(diào)味酒使用，所以進行補料厭氧發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究，以期獲得口感優(yōu)良的β-苯乙醇調(diào)味酒。

2.3 誘變菌株UV-15-15補料厭氧發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 補料比例對調(diào)味酒發(fā)酵的影響

按1.3.4方法進行補料比例的優(yōu)化試驗，結(jié)果見圖6。

圖6 補料比例對調(diào)味酒發(fā)酵效果的影響Fig.6 Effects of feeding proportion on flavoring liquor fermentation

由圖6可知，隨著補料液中新鮮麥芽汁比例的增加，β-苯乙醇產(chǎn)量持續(xù)降低，酒精度持續(xù)升高，這表明在厭氧條件下該菌轉(zhuǎn)化β-苯乙醇能力比好氧時低。感官評分呈現(xiàn)先升后降的規(guī)律，當發(fā)酵液與新鮮麥芽汁比例為1∶4時，感官評分達到最高的7.8分，此時β-苯乙醇產(chǎn)量為1.07 g/L，酒體苦味弱，玫瑰香氣較好。因此，確定補料比例為搖床發(fā)酵液∶新鮮麥芽汁=1∶4。

2.3.2 補料液L-苯丙氨酸濃度對調(diào)味酒發(fā)酵的影響

按1.3.4方法進行補料液L-苯丙氨酸濃度的優(yōu)化試驗，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，β-苯乙醇的產(chǎn)量隨L-苯丙氨酸濃度的增加而顯著提高（P＜0.05），感官評分逐漸上升，酒精度也略有增加。當L-苯丙氨酸達5 g/L時，β-苯乙醇產(chǎn)量、感官評分和酒精度都達到最高的1.14g/L、8.0分和12.0%vol。因此，確定補料液L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為5 g/L。

圖7 補料液L-苯丙氨酸濃度對調(diào)味酒發(fā)酵效果的影響Fig.7 Effects of feeding solution L-phenylalanine concentration on flavoring liquor fermentation

2.3.3 巴氏醋桿菌接種量對調(diào)味酒發(fā)酵效果的影響

根據(jù)前期試驗發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌能夠消除酒液的異雜味，按1.3.4方法進行巴氏醋桿菌接種量的優(yōu)化試驗，結(jié)果見圖8。

圖8 巴氏醋桿菌接種量對調(diào)味酒發(fā)酵效果的影響Fig.8 Effects ofA.pasteurianusinoculum on flavoring liquor fermentation

由圖8可知，隨著巴氏醋桿菌接種量的增大，β-苯乙醇產(chǎn)量和感官評分都是先升后降，酒精度都約11.0%vol，這可能是巴氏醋桿菌與釀酒酵母相互作用的結(jié)果，乙酸含量先降低后增加。巴氏醋桿菌接種量為3%（V/V）時，β-苯乙醇產(chǎn)量、感官評分和酒精度都達到最高，分別為1.21 g/L、8.5分和11.2%vol；繼續(xù)加大巴氏醋桿菌接種量，會導致酒液過酸[19]，使感官評分和酒精度下降。因此，確定巴氏醋桿菌的接種量為3%（V/V）。

2.3.4 發(fā)酵時間對調(diào)味酒發(fā)酵效果的影響

按1.3.4方法進行發(fā)酵時間的優(yōu)化試驗，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，β-苯乙醇產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，感官評分先升后降，酒精度和乙酸含量變化不顯著（P＜0.05）。發(fā)酵8 d時，β-苯乙醇產(chǎn)量高達1.17 g/L，感官評分最高，為8.9分，這表明巴氏醋桿菌能很好的消除酒液異雜味，但其作用機理還有待研究。當發(fā)酵10 d以上，β-苯乙醇產(chǎn)量相對較高，但感官評分下降，這可能是酵母自溶增加了雜味物質(zhì)的緣故[20]。因此，確定發(fā)酵時間為8 d。

圖9 發(fā)酵時間對調(diào)味酒發(fā)酵效果的影響Fig.9 Effects of fermentation time on flavoring liquor fermentation

3 結(jié)論

通過對釀酒酵母GIM2.35的紫外誘變育種，選育出β-苯乙醇產(chǎn)量提高了13.6%的釀酒酵母菌株UV-15-15，對其10次傳代發(fā)酵表明誘變菌株的遺傳性能穩(wěn)定。通過實驗優(yōu)化出好氧發(fā)酵工藝條件為麥芽汁11°P、L-苯丙氨酸5 g/L、發(fā)酵24 h，此時β-苯乙醇質(zhì)量濃度為1.69 g/L，較優(yōu)化前提高了6.3%。補料厭氧發(fā)酵工藝優(yōu)化條件為補料比例（發(fā)酵液∶新鮮麥芽汁）1∶4、補料液L-苯丙氨酸5 g/L、巴氏醋桿菌接種量3%（V/V）、發(fā)酵8 d，蒸餾酒中β-苯乙醇質(zhì)量濃度為1.17 g/L，遠高于米香型白酒低限值0.03 g/L[1]，感官評分為8.9分，酒精度11.2%vol，乙酸含量0.37g/L，因此，通過好氧發(fā)酵與添加巴氏醋桿菌的補料厭氧發(fā)酵的二步法工藝可生產(chǎn)出口感優(yōu)良的β-苯乙醇調(diào)味酒。

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Optimization of brewing technology of β-phenylethanol flavoring liquor by two-step process

WU Xuande1,LI Zhou2,ZHOU Shishui1*
(1.School of Biology and Biological Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China;2.Guangdong Gold Medal Biotechnology Co.,Ltd.,Lufeng 516600,China)

Based on previous research of synthesizing β-phenylethanol with L-phenylalanine bySaccharomyces cerevisiae,β-phenylethanol flavoring liquor was developed by UV mutant,aerobic fermentation and two-step process of feeding anaerobic fermentation.UsingS.cerevisiaeGIM2.35 as original strain,a mutant strain UV-15-15 was screened out by two-round UV-induced mutagenesis,and its β-phenylethanol synthesis ability increased 13.6%compared to the original strain.The results of single factor experiments showed that the optimal aerobic fermentation condition was wort 11°P,L-phenylalanine 5 g/L,fermentation time 24 h,and the yield of β-phenylethanol was 1.69 g/L,which was 6.3%higher than that before optimization.The optimum feeding anaerobic fermentation conditions were feeding ratio 1∶4,feeding solution L-phenylalanine 5 g/L,Acetobacter pasteurianus inoculum 3%(V/V),fermentation time 8 d.The alcohol content of the distilled liquor was 11.2%vol,acetic acid content was 0.37 g/L,β-phenylethanol concentration was 1.17 g/L,and the sensory evaluation score was 8.9.

β-phenylethanol;Saccharomyces cerevisiae;two-step process

TS262.3；TS261.4

0254-5071（2017）09-0045-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.010

2017-06-27

吳軒德（1991-），男，碩士研究生，研究方向為釀酒工程。

*通訊作者：周世水（1971-），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程與釀酒。