石 靚，韓北忠，陳晶瑜*

（中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院 食品質量與安全北京實驗室，北京 100083）

組合處理對雙菌種生物被膜的清除和殺滅效果

石 靚，韓北忠，陳晶瑜*

（中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院 食品質量與安全北京實驗室，北京 100083）

該研究建立了食源性病原菌（液化沙雷菌S1和腐生葡萄球菌S2）雙菌種生物被膜研究模型，采用微孔板法和MTT法檢測單一、組合處理方式對雙菌種生物被膜的清除和殺滅效果。研究發(fā)現，采用24孔板37℃于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h可獲得穩(wěn)定的液化沙雷菌-腐生葡萄球菌雙菌種生物被膜，組合處理方式優(yōu)于單一處理效果，處理順序的不同也會影響生物被膜的清除和殺滅效果，1%NaOH處理20 min再用0.3%NaClO處理20 min清除效果最好，雙菌種生物被膜的量由1.11（OD595nm）減少至0.08（OD595nm），殺滅率達95.73%。

雙菌種生物被膜；液化沙雷菌；腐生葡萄球菌；組合處理

生物被膜（biofilm）是自然條件下，微生物粘附于接觸表面，分泌胞外多聚物（extracellular polymeric substance，EPS）等粘性基質，將其包裹其中而形成的大量細菌聚集膜樣物，它是微生物的普遍生長方式之一[1]。其胞外多聚物主要由多糖、蛋白質、核酸、脂質等構成，這些物質使生物被膜具有復雜的形態(tài)、結構和物理化學性質[2]。相較于游離態(tài)的微生物，微生物能夠穩(wěn)定存在于環(huán)境中，大多數食源性病原菌污染的食品都是與被膜態(tài)存在的微生物有關[3]。目前生物被膜的研究多集中于單一菌種生物被膜，而在自然狀態(tài)下生物被膜以多菌種狀態(tài)生存[4]，被膜菌種差異取決于不同環(huán)境[5]，目前廣泛接受的一種方式是建立雙菌種被膜的模型來研究被膜的性狀[6-8]，從而對實際應用更具有指導意義。

單一菌種生物被膜對逆境條件和殺菌劑的抗性取決于微生物種類、接觸面材質、溫度、pH、營養(yǎng)狀況等，而混合被膜中的菌間交互協同作用將改變生物被膜的生理狀態(tài)、細胞間通信等，對增強生物被膜的抗性和耐受性起到一定作用[9-10]。環(huán)境中多以混合生物被膜形式存在，生物被膜的存在對肉品工業(yè)構成威脅，會造成產品交叉污染、貨架期縮短以及食源性疾病的傳播[11-12]。目前，對食品工業(yè)中生物被膜的清除和控制主要方式有：物理方法（高壓噴射、紫外線、超聲波處理）、化學方法（次氯酸鈉、過氧乙酸、過氧化氫、臭氧）、生物方法（酶、噬菌體）[13-14]。FERNANDESMD等[15]用不同化學試劑處理從乳清干酪中分離出的糞腸球菌和屎腸球菌混合形成的生物被膜，發(fā)現組合使用化學試劑處理效果最佳，且清潔步驟和殺菌劑種類對被膜清除至關重要。MATHIEU L等[16]證明了用水沖洗可對被膜產生剪切作用，用消毒劑氯化作用產生氧化脅迫清除75%的被膜群落，結合用物理化學作用破壞生物被膜的物理和化學的平衡，不同處理方法對生物被膜根除機制和致死機理的不同，產生不同程度的清除效果，因而，不同方法的合理組合及操作順序對控制生物被膜尤為關鍵[17]。

本研究通過建立液化沙雷菌、腐生葡萄球菌雙菌種生物被膜模型，確定最佳培養(yǎng)條件，探討各種單一、組合處理方式對雙菌種生物被膜殺滅情況，為研究雙菌種生物被膜的防治措施提供實驗材料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液化沙雷菌（Serratia liquefaciens）S1、腐生葡萄球菌（Staphylococcussaprophyticus）S2均分離自北京市通州區(qū)某肉品加工廠熟肉制品生產區(qū)；腦心浸出液肉湯（brain heart infusion，BHI）、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司；結晶紫：北京北化精細化學有限責任公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、NaOH（分析純）、68%HNO3（分析純）、苯扎氯銨（benzalkonium chloride，BC）：北京北化精細化學有限責任公司；洗潔精：上海白貓（集團）有限公司；次氯酸鈉（分析純）：濟寧恒泰化工有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；SKY-2102C振蕩培養(yǎng)箱：上海蘇坤實業(yè)有限公司；2800UV）紫外分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司；Wellscan MK3酶標儀：美國熱電有限公司；24孔細胞培養(yǎng)板（3524）：美國COSTAR公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液制備

將之前分離純化得到的液化沙雷菌S1、腐生葡萄球菌S2接種于TSA培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3%TSB中，于37℃、100 r/min分別培養(yǎng)12 h和14 h至對數中后期以備用。

1.3.2 生物被膜生物量的測定

結晶紫染色法[18]，烘干培養(yǎng)有單、雙菌株生物被膜的孔板，并用無水甲醇固定，每孔中加1 000 μL草酸銨結晶紫染色20 min，傾倒染色液后蒸餾水洗至不再褪色，晾干后每孔加1 000 μL 33%醋酸脫色，充分溶解后用酶標儀測定波長595 nm處的吸光度值。

1.3.3 生物被膜活菌量的測定

吸取無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗孔板3次，避光進行實驗操作，先加入10%MTT溶液100μL，后加入3%TSB培養(yǎng)基900μL混合均勻[19]。37℃避光培養(yǎng)5 h后取出，無菌PBS清洗后，加入1 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）靜置10 min，使結晶物甲瓚充分溶解。用酶標儀測定波長490 nm處的吸光度值[20]。

1.3.4 不同培養(yǎng)條件對單雙菌種生物被膜形成的影響

按照2%的接種量將接種于孔板中的單、雙菌株（混合比例1∶1）生物被膜分別于15℃、30℃和37℃條件下培養(yǎng)24 h，研究溫度對單、雙菌種生物被膜形成的影響；將接種有單、雙菌株生物被膜的孔板于37℃條件下培養(yǎng)24h和48h，探究培養(yǎng)時間對生物被膜的影響；將單雙菌株接種于BHI、NB、TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，探究不同培養(yǎng)基對生物被膜的影響。重復試驗3次，結晶紫染色法測定OD595nm，確定最佳培養(yǎng)條件。

1.3.5 單一處理條件對雙菌種生物被膜的影響

為探究不同單一處理條件對雙菌種生物被膜的影響，分別采用70℃、80℃、90℃恒溫水浴處理20 min，1%NaOH（pH=13.40）和1%HNO3（pH=0.80）處理無菌PBS清洗過的生物被膜20 min，0.3%NaClO、0.3%洗潔精、0.3%苯扎氯銨處理無菌PBS清洗過的生物被膜20 min，考察不同培養(yǎng)溫度、pH值、消毒洗滌劑對雙菌種生物被膜的影響。用結晶紫染色法測定生物被膜的生物量，用MTT染色法測定生物被膜中微生物的殺滅率。殺滅率計算公式如下：

1.3.6 雙重處理條件對雙菌種生物被膜的影響

為探究不同溫度和pH值交互處理對生物被膜的影響，采用不同溫度（70℃、80℃或90℃）結合不同pH值條件（1%NaOH或者1%HNO3溶液）同時處理，條件設計如表1所示。

表1 不同溫度和pH值處理方法Table 1 Treatments of different temperature and pH

為探究不同溫度和消毒/洗滌劑交互處理對生物被膜的影響，采用不同溫度（70℃、80℃或90℃）結合不同消毒/洗滌劑（0.3%NaClO、0.3%洗潔精或0.3%BC）同時處理，條件設計如表2所示。

為探究pH值和消毒/洗滌劑交互處理對生物被膜的影響，采用不同pH環(huán)境（1%NaOH或1%HNO3）結合不同消毒/洗滌劑（0.3%NaClO、0.3%BC或0.3%洗潔精）分別處理，處理方案如表3所示。

表2 不同溫度和消毒/洗滌劑處理方法Table 2 Treatments of different temperature,disinfectants and detergents

表3 不同pH和消毒/洗滌劑處理方法Table 3 Treatments of different pH,disinfectants and detergents

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對單、雙菌株生物被膜生長情況的影響

不同培養(yǎng)時間、溫度條件對單、雙菌種生物被膜生物量的影響情況如圖1、圖2所示。

圖1 培養(yǎng)時間對單、雙菌株生物被膜形成的影響Fig.1 Effect of incubation time on the formation of single-and dual-species biofilms

由圖1可知，液化沙雷菌和雙菌種混合（1∶1）培養(yǎng)形成的生物被膜量隨著時間的延長均呈現增長的情況，而腐生葡萄球菌情況相反，培養(yǎng)48 h后形成的生物被膜量比24 h的要少，且雙菌種混合生物被膜的量在培養(yǎng)24h和48h后均多于相應時間下單菌株生物被膜的量。盡管雙菌種混合培養(yǎng)48h形成的生物被膜的量多于24h的培養(yǎng)，但為了符合實際生產條件的情況以及避免腐生葡萄球菌培養(yǎng)48 h形成生物被膜量少于培養(yǎng)24 h這一情況對實驗可能造成的影響，在后續(xù)的試驗中選用培養(yǎng)24 h形成的單、雙菌株生物被膜進行實驗處理。

圖2 溫度對單、雙菌株生物被膜形成的影響Fig.2 Effect of temperature on the formation of single-and dual-species biofilms

由圖2可知，在15℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后，兩株單菌株分別培養(yǎng)以及混合菌株培養(yǎng)形成的生物被膜生物量相比較于30℃和37℃條件下形成的生物被膜量最少，說明低溫是抑制生物被膜形成的因素，與文獻結論一致[21]。37℃條件下形成的生物被膜量還是略高于30℃生物被膜量。此外，37℃是兩種細菌的最適生長溫度，說明在最適生長溫度下利于這兩種細菌更分泌胞外物質，從而導致被膜生物量的積累。在3種不同溫度下混合生物被膜的形成量均多于單一菌種的生物被膜量。

2.2 單一處理方式對雙菌株生物被膜清除和殺滅試驗

在各種處理方式一次處理后對生物被膜生物量和殺滅率的影響情況如圖3、圖4所示。

圖3 單一處理方式對雙菌種生物被膜的清除作用Fig.3 Removal effects of different single treatments on dual-species biofilms

由圖3可知，隨著對雙菌株生物被膜處理溫度的升高，其生物量逐漸降低。對生物被膜用1%NaOH或1%HNO3處理20 min后，可發(fā)現用1%NaOH處理對生物被膜的清除效果比1%HNO3要好。在使用消毒/洗滌劑一次處理后，可發(fā)現對生物被膜的清除效果由強到弱排序為0.3%NaClO＞0.3%BC＞0.3%洗潔精。由圖4可知，在不同溫度處理中，隨著溫度的升高，對生物被膜中微生物的殺滅效果增強，與生物量清除效果的測定結果一致。對生物被膜用1%NaOH或1%HNO3處理20 min后，兩者對生物被膜的殺滅效果差別不大，對生物被膜中的微生物并未完全殺死，說明生物被膜的胞外多聚物對其包裹的微生物有一定的保護作用。酸堿都能滲入到微生物胞內從而使其致死，而1%NaOH清除與殺滅作用都很明顯，可能原因是NaOH能通過皂化反應清除構成生物被膜胞外多聚物的主要成分脂肪和蛋白等，有利于NaOH的滲入，HNO3通過化學反應去除鈣鹽和礦物油等，其所占胞外多聚物的比例并不大。消毒/洗滌劑一次處理對生物被膜中微生物的殺滅效果由強到弱排序為0.3%NaClO＞0.3%BC＞0.3%洗潔精。與圖3比較發(fā)現，0.3%洗潔精對生物被膜有較強的去除效果但對微生物的殺滅作用極弱，這是由于洗潔精的主要成分是烷基磺酸鈉、脂肪醇醚硫酸鈉，兩者都是陰離子表面活性劑，具有良好的去污和乳化力，對生物被膜具有一定的剝離效果，但難以滲入到細菌胞內產生致死效果。

2.3 組合處理方式對雙菌株生物被膜清除和殺滅實驗

組合處理方式（不同溫度和pH值、不同溫度和消毒/洗滌劑、pH值和消毒/洗滌劑）對單、雙菌株生物被膜清除和殺滅情況的實驗結果分別如圖5～圖7所示。

由圖5可知，與單一處理方式相比較，組合處理方式能夠顯著提升對雙菌株生物被膜的清除效果和對其中細菌的殺滅率（P＜0.05）。在不同pH值或不同處理順序下不同溫度對生物被膜的清除效果隨著溫度的升高而逐漸增強，這與上述單一不同溫度處理方式的結果一致，但不同溫度與不同pH值組合處理時，溫度的提升對殺滅率無顯著提升。在熱水協同處理有1%NaOH參與的處理A1、A3、A5中，無論是對生物被膜的清除效果還是對其中微生物的殺滅程度皆優(yōu)于有1%HNO3參與的處理。這是由于NaOH能去除生物被膜上的蛋白質、脂質等主要構成物質，失去了胞外多聚物的保護使構成生物被膜的細菌更容易受到不同溫度脅迫以及離子滲入而致死。圖5中可見組合處理作用順序的不同對生物被膜中微生物的清除殺滅效果也會不同，在1%NaOH與熱水處理的組合中，對生物被膜清除殺滅效果由強到弱順序為A5：先1%NaOH后熱水處理＞A1：1%NaOH與熱水共同作用＞A3：先熱水后1%NaOH處理。可見相同的處理因素不同的處理順序會有不同的效果，為優(yōu)化實際生產中消毒/洗滌步驟提供了一定的理論依據。

圖4 單一處理方式對雙菌種生物被膜的殺滅效果Fig.4 Killing efficacy of different single treatments on dual-species biofilms

圖5 組合處理方式（不同溫度和pH值）對雙菌株生物被膜清除和殺滅效果Fig.5 Removal effect and killing efficacy of combination treatments(different temperature and pH)on dual-species biofilms

由圖6可知，在不同溫度與消毒/洗滌劑共同處理情況下，生物被膜的清除殺滅效果并沒有隨著溫度的升高而升高。采用0.3%NaClO與熱水的組合方式相較于0.3%BC、0.3%洗潔精和熱水的組合方式，對生物被膜的清除殺滅效果為最優(yōu)，其中根據處理順序不同處理效果由大到小排列為B1：0.3%NaClO共熱水＞B4：先熱水后0.3%NaClO＞B7：先0.3%NaClO后熱水，可見0.3%NaClO與水共熱能夠使得NaClO發(fā)揮出最強的清除生物被膜殺滅其中細菌的效果。在本組試驗中，當0.3%BC與不同溫度熱水同時作用于生物被膜時，對生物被膜的清除效果甚至不如單獨采用不同溫度處理，但對其中細菌的殺滅率很高，在80℃和90℃時與BC共同作用殺滅率甚至達100%，說明0.3%BC與不同溫度熱水同時作用僅僅是將生物被膜中的細菌殺死，而殘存有死亡菌體與胞外多聚物在經處理過的表面仍然可被結晶紫所染色。在0.3%洗潔精與不同溫度熱水的組合B2、B5、B8中，可見洗潔精對生物被膜的清除效果較為顯著而對其中細菌的殺滅效果較差，此現象與上述實驗圖3所示單一操作處理的結果相一致。

由圖7可知，在pH與消毒/洗滌劑共同作用下，可以發(fā)現在先使用NaOH的操作中，對生物被膜具有最好的清除效果和殺滅率，其次是先使用0.3%NaClO再使用別的操作，尤其是先使用0.1%NaOH再使用0.3%NaClO處理生物被膜的時候清除與殺滅的效果最為良好。在本組試驗中，可發(fā)現0.3%BC的殺滅效果甚至優(yōu)于0.1%NaOH以及0.3%NaClO，但其對生物被膜的清除效果是這5種組合操作中最差的，此結果與上述圖6結果相一致。在本組pH與消毒/洗滌劑共同作用的實驗中，BC對生物被膜的清除能力以及洗潔精對生物被膜的殺滅能力都較弱，但聯合使用其他處理方式彌補了以上兩種對生物被膜的作用劣勢，并且較大程度地發(fā)揮了優(yōu)勢。

圖7 組合處理方式（pH值和消毒/洗滌劑）對雙菌株生物被膜清除和殺滅效果Fig.7 Removal effect and killing efficacy of combination treatments(pH and disinfectant/detergent)on dual-species biofilm

3 結論

溫度、營養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間都能影響由液化沙雷菌和腐生葡萄球菌所構成的雙菌種生物被膜的生長，選用TSB培養(yǎng)基和接近最適生長溫度（37℃）最有利于雙菌種生物被膜的大量生長，在雙菌種生物被膜的培養(yǎng)過程中需要考慮浮游狀態(tài)細菌和生物被膜狀態(tài)的細菌的營養(yǎng)競爭以及兩種細菌之間的相互作用，選取生長24 h的雙菌種生物被膜進行下一步實驗符合實際生產條件。

不同溫度、pH值、消毒/洗滌劑對生物被膜處理皆具有顯著的清除效果，組合處理方式相較單一處理方式有效提升了對雙菌種生物被膜的清除和殺滅效果，采用1%NaOH和0.3%NaClO兼?zhèn)淞藦娏η宄透咝绲哪芰?。兩者聯合使用處理順序的不同也會影響到處理結果，雙重處理先用1%NaOH處理20 min再用0.3%NaClO處理20 min清除效果最佳，雙菌種生物被膜的量由1.11（OD595nm）減少至0.08（OD595nm），殺滅率可達95.73%。雙菌種生物被膜研究模型的構建為研究自然狀態(tài)下的生物被膜提供了理論依據，控制生物被膜處理方式的探究，為制定食品加工中控制生物被膜的有效措施提供了試驗數據與理論參考。

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Removal effect and killing efficacy of combination treatments on dual-species biofilms

SHI Liang,HAN Beizhong,CHEN Jingyu*
(Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The study mainly focused on the establishment of a dual-species biofilm model formed by two foodborne pathogenic bacteriaSerratia liquefaciensS1 andStaphylococcus saprophyticusS2.Microtitor-plate method and MTT assay were used to measure the removal effect and killing efficacy of single or combination treatments on dual-species biofilm formation.The results showed that the stable dual-species biofilms,consisting of S.liquefaciensS1 andS.saprophyticusS2,could be obtained in tryptone soy broth(TSB)at 37℃for 24 h.The effects of combined treatments were better than single treatments.Moreover,in combined treatments,the removal effect and killing efficacy were also influenced by treatment orders.Resultsindicated that when the dual-species biofilms were treated with 1%NaOH for 20 min firstly and then disposed with 0.3%NaClO for another 20 min,the removal effects of biofilms were better than that under other conditions,while the dual-species biofilms quantity decreased from 1.11(OD595nm)to 0.08(OD595nm)and the killing efficacy reached to 95.73%.

dual-species biofilms;Serratia liquefaciens;Staphylococcus saprophyticus;combination treatment

TS201.3

0254-5071（2017）09-0019-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.005

2017-04-12

國家自然科學基金資助項目（31371716）

石 靚（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：陳晶瑜（1978-），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物學與分子生物學。