陳 敏，王園媛，黎 霞，李慧敏，吳 旻，張 顥，王其剛，張 婷，蹇洪英*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650200；2.云南師范大學(xué)文理學(xué)院，云南 昆明 650222)

月季‘云粉’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的初步研究

陳 敏1，王園媛2，黎 霞1，李慧敏1，吳 旻1，張 顥1，王其剛1，張 婷1，蹇洪英1*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650200；2.云南師范大學(xué)文理學(xué)院，云南 昆明 650222)

【目的】本文探討了切花月季自育品種‘云粉’作父本時(shí)結(jié)籽率差異顯著且較低的原因?！痉椒ā恳愿牧嫉闹破▽?duì) ‘云粉’的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期進(jìn)行了觀察?！窘Y(jié)果】觀察‘云粉’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的最佳時(shí)期是當(dāng)花藥由淡綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色、花蕾橫徑為1.03～1.07 cm、縱徑為2.9～3.4 cm大小時(shí)；在同一花藥中,花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂并不同步,可以觀察到不同時(shí)期的分裂相?；ǚ勰讣?xì)胞在減數(shù)第1次分裂過(guò)程中存在單價(jià)體、三價(jià)體、染色體橋等異?，F(xiàn)象，減數(shù)第2次分裂末期觀察到三分體和二分體?！窘Y(jié)論】‘云粉’因花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程存在異常分裂現(xiàn)象，從而產(chǎn)生2n雄配子，在一定程度上降低了其作父本時(shí)的結(jié)籽率。

月季；花粉母細(xì)胞；減數(shù)分裂；2n雄配子；結(jié)籽率

【研究意義】月季(RosahybridaL.)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(RosaL.)植物，是重要的觀賞植物，也是世界第一大切花[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)占有市場(chǎng)份額的切花月季品種除經(jīng)芽變選育的‘金輝’[3]外，幾乎全部來(lái)自國(guó)外。缺乏具有市場(chǎng)占有率的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的切花月季品種已成為中國(guó)月季產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。隨著UPOV1991文本的逐漸實(shí)施，通過(guò)雜交選育獲得月季新品種就顯得尤為緊迫[4]，然而月季雜交育種中卻存在雜交不親和、雜種高度不育[5]、以及很多組合不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率較低等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了育種進(jìn)程[6]。植物育種歸根到底是對(duì)物種(品種)染色體及染色體外遺傳結(jié)構(gòu)的改良[7-8]。研究月季的花粉母細(xì)胞(PMCs)的減數(shù)分裂行為，可了解各品種或種在細(xì)胞學(xué)層面的遺傳特性，為雜交親本的選擇、雜交后代和新品種的鑒定等提供首要依據(jù)[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)以來(lái)，研究人員對(duì)薔薇屬植物的倍性和細(xì)胞核型進(jìn)行了廣泛的研究[10-27]，但減數(shù)分裂方面的研究較少。Lim等[21]以rDNA 為探針的染色體熒光原位雜交技術(shù)(FISH)對(duì)狗薔薇(R.canina， 2n=5x=35)的體細(xì)胞和花粉母細(xì)胞(PMCs)染色體進(jìn)行了分析，證明狗薔薇只有1對(duì)同源染色體，因在減數(shù)分裂過(guò)程中穩(wěn)定地發(fā)生不等分裂而能進(jìn)行有性生殖。Ma等[21]對(duì)金櫻子及其雜交子代的減數(shù)分裂進(jìn)行了觀察和分析。羅玉蘭等[22]對(duì)粉團(tuán)薔薇(R.multifloraThunb.var.cathayensisRehd.)進(jìn)行減數(shù)分裂研究的結(jié)果表明該變種為部分同源三倍體。 月季品種‘云粉’是從‘奶油妹’ב木瓜粉’的雜交后代群中選育而成的，是國(guó)內(nèi)首個(gè)通過(guò)雜交選育并授權(quán)的切花月季新品種[28-29]。【本研究的切入點(diǎn)】研究發(fā)現(xiàn)‘云粉’作父本時(shí)各組合結(jié)實(shí)率差異極顯著(0～47.6 %)，單花結(jié)籽數(shù)很低(0～6.47粒)[30]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)‘云粉’PMCs的減數(shù)分裂過(guò)程進(jìn)行觀察，旨在了解‘云粉’PMCs的減數(shù)分裂行為是否是導(dǎo)致其作為父本時(shí)結(jié)實(shí)率差異明顯及結(jié)籽數(shù)低甚至為0的原因，為利用‘云粉’進(jìn)行雜交育種提供細(xì)胞學(xué)方面的理論依據(jù)，同時(shí)也為研究其他薔薇屬植物的PMCs減數(shù)分裂行為提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

‘云粉’為灌木，植株直立，花單生于莖頂，花梗長(zhǎng)而堅(jiān)韌，闊瓣大花型，外花瓣比內(nèi)花瓣稍淺，淺粉色，內(nèi)花瓣淺粉色，花瓣23～32枚(圖1-A)；切枝長(zhǎng)度60～80 cm，莖的中上部近無(wú)刺，莖的中下部皮刺較多；年產(chǎn)量20枝/株；瓶插壽命8～10 d[28]。實(shí)驗(yàn)材料保存在位于昆明市北郊的云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所月季種質(zhì)資源圃內(nèi)(圖1-B)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材及預(yù)處理 于4月下旬‘云粉’現(xiàn)蕾時(shí)開始，每天上午9:00時(shí)進(jìn)行采樣。從小到大依次遞增選取處于不同發(fā)育階段的幼嫩花蕾若干(圖2-A)。剝?nèi)セɡ俚妮嗥突ò?圖2-B)，去掉雌蕊后用CarnoyⅠ(無(wú)水乙醇∶乙酸=3∶1，V∶V)固定24～72 h。固定好的材料用75 %的乙醇清洗后再用75 %的乙醇于4℃保存。

圖1 切花月季品種‘云粉’(A:花; B:田間保存)Fig.1 Cut rose Rosa ‘Yunfen’ (A: Flower; B: Resources in the nursery)

圖2 不同發(fā)育階段的花蕾及對(duì)應(yīng)的花藥形態(tài) (A: 花蕾 B：花藥)Fig.2 Buds and their corresponding anthers at different developing stage (A:Buds; B:Anthers)

A：常規(guī)壓片法，雜質(zhì)多；B：改良?jí)浩?，?xì)胞分散好，視野中雜質(zhì)少A: Conventional method with more impurity substances; B: Improved method with less impurity substances and much more scattered cells圖3 不同制片法顯微觀察的視野效果Fig.3 Visual field of different dying and pressing method in the microscope

1.2.2 染色及壓片 采用改良卡寶品紅染色法。將保存的花藥用清水沖洗后放入0.1 %的H Cl中，在室溫下酸解20 min。清水漂洗后再用卡寶品紅染色1 h，取出染好色的花藥再次用清水沖洗。將洗凈的花藥置于潔凈的載玻片上，滴1～2滴40 %乙酸脫色，切碎花藥蓋上蓋玻片并輕敲蓋玻片使細(xì)胞分散。最后封片供鏡檢。

1.2.3 顯微觀察 臨時(shí)片在Olympus CH300 顯微鏡40×下鏡檢,在Nikon E800 顯微鏡100×下用DXM1200型顯微圖像捕捉系統(tǒng)拍照記錄減數(shù)分裂的整個(gè)過(guò)程及其中出現(xiàn)的裂常分裂現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 制片

常用的制片技術(shù)是挑取未經(jīng)酸解的花藥到潔凈的載玻片上，滴上染料，然后挑開花藥使花粉母細(xì)胞釋放出來(lái)快速染色后直接壓片。這種方法快捷簡(jiǎn)便，但制出的片子背景有較多雜質(zhì)，影響觀察(圖3-A)。對(duì)于月季來(lái)說(shuō)，由于花藥較小且較硬，不易將花粉母細(xì)胞(PMCs)從沒有酸解過(guò)的花藥中擠壓出來(lái)，壓片較困難。本實(shí)驗(yàn)在染色前先進(jìn)行酸解，使花藥變得柔軟，有利于PMCs散出及后期的染色和壓片，制片中細(xì)胞分散較好，便于觀察(圖3-B)。

2.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂與花蕾形態(tài)特征的相關(guān)性

‘云粉’PMCs減數(shù)分裂與花蕾的發(fā)育程度相關(guān)，包括花蕾橫徑、花萼形態(tài)，尤其與花藥色澤的關(guān)系最大，與花蕾縱徑?jīng)]有明顯關(guān)系。其減數(shù)分裂是在花蕾橫徑為1.03～1.07 cm、花藥由淡綠色(圖2-6)轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色(圖2-5)之間進(jìn)行的，此時(shí)萼片尚未開裂。當(dāng)花藥處于黃綠色時(shí)，無(wú)論花蕾長(zhǎng)/短(縱徑2.9～3.4 cm)，PMCs都處于減數(shù)分裂階段；反之，當(dāng)花藥處于淡綠色時(shí)，即使花蕾較大，花粉母細(xì)胞也未進(jìn)行減數(shù)分裂(表1)。

2.3 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為

通過(guò)對(duì)20個(gè)以上體細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)表明‘云粉’為四倍體(2n=4x=28)。本研究中，‘云粉’的花粉母細(xì)胞(圖4-A，左)相對(duì)藥壁細(xì)胞(圖4-A,右)等體細(xì)胞來(lái)說(shuō)較大較圓，染色程度也比體細(xì)胞更深，易于區(qū)分。通過(guò)對(duì)其減數(shù)分裂后期Ⅱ的染色體觀察(圖4-B)，進(jìn)一步證實(shí)了其染色體數(shù)目為28條。

實(shí)驗(yàn)中觀察到了‘云粉’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂至花粉粒形成的全過(guò)程(圖5-A～K)。 前期I(圖5-B) 比較復(fù)雜，在其中可觀察到三價(jià)體、二價(jià)體、單價(jià)體(圖5-L)。中期I(圖3-D)各成對(duì)的同源染色體雙雙移向細(xì)胞中央的赤道板，著絲點(diǎn)成對(duì)排列在赤道板兩側(cè)，細(xì)胞質(zhì)中形成紡錘體。后期I(圖5-E)由紡錘絲的牽引，使成對(duì)的同源染色體各自發(fā)生分離，并分別移向兩極，在其中可以觀察到染色體橋(圖5-M)。減數(shù)第二次分裂染色體不再?gòu)?fù)制，每條染色體的著絲點(diǎn)分裂，姐妹染色單體分開，分別移向細(xì)胞的兩極(圖5:L)，有時(shí)還伴隨細(xì)胞的變形。減數(shù)第二次分裂實(shí)際上是一次普通的有絲分裂。在中期Ⅱ中觀察到八字紡綞體(圖5-G)，減數(shù)分裂Ⅱ完成后除形成四分體外(圖5-N)還觀察到三分體(圖5-O)和二分體(圖3-P)。

表1 ‘云粉’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程與花蕾大小、花萼形態(tài)和花藥色澤的相關(guān)性Table 1 Correlation between meiotic process and bud size,calyx morphology,anther colour of Rosa ‘Yunfen’

A:花粉母細(xì)胞(左)與藥壁細(xì)胞(右)；B：減數(shù)分裂后期Ⅱ時(shí)的染色體(n=x=14)A: Pollen mother cells (left) and anther wall cells (right); B: Chromosomes in anataphaseⅡ(n=x=14)圖4 ‘云粉’的花粉母細(xì)胞及減數(shù)分裂后期Ⅱ時(shí)的染色體Fig.4 Pollen mother cells of Rosa‘Yunfen’and chromosomes in its anataphaseⅡ

A: 間期Ⅰ；B: 前期Ⅰ；C: 中期Ⅰ；D: 后Ⅰ；E: 末期Ⅰ； F: 間期Ⅱ；G: 中期Ⅱ；H: 后期Ⅱ；I: 末期Ⅱ；J: 即將釋放的花粉；K: 成熟花粉；L：后期Ⅰ中觀察到的異常分裂現(xiàn)象(左：三價(jià)體，右：?jiǎn)蝺r(jià)體)；M: 減數(shù)分裂的非同步性；N: 四分體；O: 三分體；P: 二分體A: IntervalⅠ; B: ProphaseⅠ; C: Metaphase Ⅰ; D: AnaphaseⅠ; E: TelophaseⅠ; F: Interval Ⅱ; G: MetaphaseⅡ; H: AnaphaseⅡ; I: TelophaseⅡ; J: Pollens which will be released; K: Mature pollens; L: Abnomalities in the anaphase Ⅰ(left arrow: Trivalent; Right arrow: Univalent); M: Non-synchronism of PMCs meiosis division; N: Tetrad; O: Triad; P: Dyad圖5 ‘云粉’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程 Fig.5 Meiosis process of R.‘Yunfen’ pollen mother cells

2.4 ‘云粉’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的不同步性

‘云粉’從枝條頂端開始現(xiàn)蕾發(fā)育，即使同一植株不同枝條的花蕾發(fā)育程度也不同。在同一花蕾中，外輪花藥分裂比內(nèi)輪花藥快。同一個(gè)花藥中的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂速度也不完全一致(圖5-M)，同一視野里可以觀察到分別處于分裂后期I(a)和分裂末期I(b)的細(xì)胞。

3 討 論

3.1 花粉母細(xì)胞的識(shí)別

由于壓片時(shí)是將整個(gè)花藥都?jí)荷先ィ栽阽R檢時(shí)最重要的是分清楚花粉母細(xì)胞和藥壁細(xì)胞以及其他組織細(xì)胞。只有正確地找到了花粉母細(xì)胞才能觀察減數(shù)分裂的進(jìn)程?；ǚ勰讣?xì)胞和藥壁細(xì)胞的主要區(qū)別有：花粉母細(xì)胞較大，一般是藥壁細(xì)胞的2倍以上(圖4-A，左)?；ǚ勰讣?xì)胞第一次分裂后產(chǎn)生的2個(gè)子細(xì)胞即二分子，各呈半球形；第二次分裂后產(chǎn)生的4個(gè)子細(xì)胞即四分子，各呈1/4球形，這些特征是藥壁細(xì)胞分裂過(guò)程中所沒有的。在減數(shù)分裂過(guò)程中，花粉母細(xì)胞的大小一般變化不大，因此可根據(jù)第二次分裂期細(xì)胞的大小確認(rèn)第一次分裂期的花粉母細(xì)胞?；ǚ勰讣?xì)胞外圍較圓，基本看不到細(xì)胞壁，而藥壁細(xì)胞常呈多邊形，細(xì)胞壁清晰可見[17]，但是并不是所有花粉母細(xì)胞都是較圓，早期的花粉母細(xì)胞也有其他形狀的，如：方形、多邊形以及一些不規(guī)則的形狀。因此在觀察時(shí)不能只看其中的某一方面就錯(cuò)認(rèn)為是花粉母細(xì)胞，而要幾個(gè)方面全部結(jié)合起來(lái)綜合觀察，才能確認(rèn)是不是花粉母細(xì)胞。另外，花粉母細(xì)胞染色比其他的細(xì)胞較深，且是整個(gè)細(xì)胞都被染上顏色。其他組織的細(xì)胞只是細(xì)胞的壁以及細(xì)胞核染上顏色，細(xì)胞內(nèi)不染色或只染上很淺的顏色。

3.2 ‘云粉’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常與育性的關(guān)系

在‘云粉’PMCs減數(shù)分裂后期Ⅱ中觀察到八字形紡錘體(圖5-G)，致使一部分PMCs形成三分體。在‘云粉’PMCs減數(shù)分裂過(guò)程中除三分體外還觀察到二分體，它們都將產(chǎn)生2n配子。這首先降低了n花粉的數(shù)量，其次所形成的2n配子如果在與不能形成2n雌配子或親和性較低的品種雜交時(shí)，將降低結(jié)實(shí)率和結(jié)籽率。當(dāng)其作為父本時(shí)，它的n配子與產(chǎn)生n配子的母本(2n=4x=28)雜交將產(chǎn)生4倍體雜交后代，它的2n配子與此母本雜交將幾乎不結(jié)實(shí)。由于薔薇屬植物自然產(chǎn)生 2n 配子的比例不超過(guò)3.5 %[12]，因此，‘云粉’產(chǎn)生2n配子，雖然將在一定程度上降低了其作父本時(shí)的結(jié)籽率，但可能不是‘云粉’做父本時(shí)結(jié)實(shí)率差異較大、單花結(jié)籽數(shù)低的主要原因。在‘云粉’PMCs減數(shù)分裂Ⅰ中觀察到三價(jià)體、二價(jià)體、單價(jià)體，由于同源四倍體產(chǎn)生三價(jià)體的幾率極低[7]，由此推測(cè)‘云粉’可能不是同源四倍體，那么親本之間染色體組的差異就可能是造成其作‘父本’時(shí)結(jié)實(shí)率差異較大的原因。但相同組合的反交實(shí)驗(yàn)表明，以‘云粉’作母本時(shí)的結(jié)實(shí)率很高(73.5 %～94.3 %)、相應(yīng)的單花結(jié)籽數(shù)也高(13.65～21.46粒)[30]，這說(shuō)明親本之間的染色體組差異不大，不會(huì)導(dǎo)致其作‘父本’時(shí)結(jié)實(shí)率差異較大。張顥等的研究表明，月季花粉的萌發(fā)率是影響月季雜交結(jié)實(shí)率的關(guān)鍵因素[5]，而‘云粉’的花粉活力中等(離體萌發(fā)率：33.34 %± 1.70 %，活體萌發(fā)率：31.56 %± 1.63 %)[31]，當(dāng)其作為父本與親和性較低的品種雜交時(shí)，會(huì)在一定程度上降低結(jié)實(shí)率、尤其是結(jié)籽率，但也不會(huì)致使其結(jié)實(shí)率和結(jié)籽數(shù)為0。因此，‘云粉’因花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程存在異常分裂現(xiàn)象，從而產(chǎn)生2n配子，會(huì)在一定程度上影響其在雜交育種中做父本時(shí)的結(jié)實(shí)率。要研究‘云粉’作父本時(shí)結(jié)實(shí)率差異較大的主要原因還需結(jié)合其它方面的研究，如確定異常分裂的花粉母細(xì)胞的比例、2n花粉數(shù)量及其萌發(fā)率，花粉與不同品種之間的親和性，等。雖然‘云粉’作為父本存在一定的局限性，但其作為母本的優(yōu)勢(shì)明顯[30]，是作為切花月季雜交育種的優(yōu)異種質(zhì)資源。

4 結(jié) 論

‘云粉’是中國(guó)國(guó)內(nèi)首個(gè)通過(guò)雜交選育并獲授權(quán)的切花月季新品種。研究表明當(dāng)其花蕾橫徑為1.03～1.07 cm、縱徑為2.9～3.4 cm大小、花藥由淡綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色時(shí)最適合進(jìn)行花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察。‘云粉’花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂存在不同步性，在減數(shù)第一次分裂過(guò)程中還存在單價(jià)體、三價(jià)體、染色體橋等異常現(xiàn)象，減數(shù)第二次分裂末期存在三分體和二分體，最終產(chǎn)生2n雄配子，從而在一定程度上降低了它在月季雜交育種中作父本時(shí)的結(jié)籽率。

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ObservationonPollenMotherCellMeiosisofNewRoseCultivar,Rosa‘Yunfen’

CHEN Min1， WANG Yuan-yuan2,LI Xia1,LI Hui-min1,WU Min1,ZHANG Hao1,WANG Qi-gang1,ZHANG Ting1,JIAN Hong-ying1*

(1.Flower Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Key Laboratory for Flower Breeding/National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture，Yunnan Kunming 650200，China；2.College of Arts and Sciences,Yunnan Normal University，Yunnan Kunming 650222，China)

【Objective】Rosa‘Yunfen’ was a plant breeders’ right owned new cut rose cultivar.The rose hip and achene setting rates were very low and differred significantly among crossing combinations whenR.‘Yunfen’ was used as the paternal parents in hybridization breeding.【Method】To find the reason,pollen mother cell meiosis ofR.‘Yunfen’ was observed and the meiotic phases in different periods of the division were recorded in this study.【Result】The optimal time for observation of meiosis was when the bud was about 1.03-1.07 cm wide and 2.9-3.4 cm long.At that stage,the anther colour turned from light green to yellowish green.The meiotic behaviors of pollen mother cells were non-synchronic and several meiosis phases could be observed in the same anther.Abnormal phenomina of meiosis such as univalent,trivalent and chromosome-bridge could be observed in the first division of meiosis.Then,triad and dyad were produced in the second division of meiosis ofR.‘Yunfen’,by which 2n pollens were formed.【Conclusion】The abnormal division of PMCs ofR.‘Yunfen’ might be a reason for the low hip and achene setting rate when used as paternal parent in breeding.

RosahybridL.； Pollen mother cell (PMC)； Meiosis； 2n pollen； Hip and achene setting rate

1001-4829(2017)4-0881-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.028

2015-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目(31060267,31560301)

陳 敏(1974-)，男，實(shí)驗(yàn)師，現(xiàn)從事花卉育種研究，E-mail: 215652969@qq.com，*為通訊作者,蹇洪英，E-mail: ynwildflower@aliyun.com。

S685.12

A

(責(zé)任編輯 王家銀)