劉洋 閆蕊 李祥廷

煙熏大鼠心肌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)

劉洋1閆蕊2李祥廷1

目的 研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在煙熏大鼠心肌組織中的表達(dá)，探討吸煙對大鼠心肌損傷的影響及可能機(jī)制。方法 SD大鼠隨機(jī)分入對照組和實驗組，實驗組給予煙熏干預(yù)，8周后觀察心肌形態(tài)學(xué)改變，并通過免疫組化染色及蛋白質(zhì)印跡法觀察HIF-1α、VEGF在兩組大鼠心肌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 與對照組比較，實驗組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，且較為稀疏，部分肌原纖維扭曲甚至斷裂。免疫組化染色及蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組HIF-1α表達(dá)顯著增加，而實驗組VEGF表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0．05）。結(jié)論 吸煙可通過誘導(dǎo)大鼠心肌組織中HIF-1α表達(dá)上調(diào)、抑制VEGF表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)心肌損傷。

煙熏；心肌組織；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長因子

吸煙會對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，是冠心病發(fā)生和進(jìn)展的一個重要獨(dú)立危險因素[1]。作為主要的可預(yù)防性環(huán)境有害因素，吸煙對心血管系統(tǒng)的影響及其發(fā)病機(jī)制也越來越受到人們的關(guān)注。

缺氧誘導(dǎo)子因子-1（HIF-1）是一種隨著細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，為異二聚體，由氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α和結(jié)構(gòu)亞單位HIF-1β組成。在正常氧濃度下，HIF-1α的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域上的特異性脯氨酰基被氧依賴性脯氨酰羥化酶羥基化，繼而與腫瘤抑制蛋白結(jié)合，通過泛素-蛋白酶途徑使HIF-1α迅速降解[2]。而在低氧條件下，HIF-1α穩(wěn)定性增加，與HIF-1β亞單位結(jié)合形成二聚體HIF-1，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄過程[3]。HIF-1α既是HIF-1的調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，HIF-1的生理活性主要取決于HIF-1α的活性和表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是特異性的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂與增值、誘導(dǎo)新生血管生成、增加微血管通透性等重要生物學(xué)功能[4]。VEGF基因是受HIF-1α調(diào)控的重要靶基因之一，多項研究表明缺血性心臟病患者體內(nèi)HIF-1α、VEGF的表達(dá)增加，然而目前尚未見到有關(guān)吸煙對心肌組織HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響的報道。本研究通過煙熏干預(yù)建立動物模型，旨在通過研究煙熏大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變及其HIF-1α、VEGF的表達(dá)情況，探討吸煙對心肌損傷的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠18只，體質(zhì)量（150±15）g，均購于西安交通大學(xué)實驗動物中心。所有動物在室溫下飼養(yǎng)，均自由進(jìn)食、進(jìn)水，接受自然光照。七匹狼烤煙型香煙，福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司；山羊抗鼠血清，博士德生物工程有限公司；一抗為抗HIF-1α抗體、抗VEGF抗體，Abcam公司；二抗試劑盒，中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑，博士德生物工程有限公司；BCA試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；內(nèi)參β-actin單克隆抗體，三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體，西安壯志生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組處理 將18只SD大鼠隨機(jī)分為對照組和實驗組，將實驗組（n=9）大鼠置于30 cm×40 cm×60 cm的透明密閉容器內(nèi)予以香煙煙熏，5支/次，30 min/次，2次/日，兩次之間間隔6小時，共8周；對照組（n=9）大鼠自由進(jìn)食，共8周。

1.2.2 心肌形態(tài)學(xué)觀察 處死大鼠后取其心肌組織，進(jìn)行以下操作：石蠟包埋，切片機(jī)切片，烤片，脫蠟至水，放蘇木素液內(nèi)5分鐘，水洗，2%鹽酸酒精分化10秒，水洗，放入1/500的氨水中至切片變藍(lán)，水洗，放1%伊紅內(nèi)染5分鐘，水洗，脫水透明，樹膠封片，鏡下觀察并圖像保存。

1.2.3 免疫組化 檢測大鼠心肌組織中HIF-1α、VEGF的表達(dá)，具體操作步驟如下（以HIF-1α為例）：石蠟切片脫蠟至水，應(yīng)用pH值為6.0、濃度為0.01 M的檸檬酸緩沖液微波進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2去離子水孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗滌，加入山羊抗鼠血清封閉，室溫孵育15 min，加入1：250稀釋的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗。DAB顯色工作液避光孵育10 min，PBS沖洗后蘇木素復(fù)染1 min，自來水沖洗。脫水、透明，封片后顯微鏡下觀察。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot） 使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，計算50 μg蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，繼而轉(zhuǎn)印到PVDF膜，脫脂奶粉封閉后分別用HIF-1α 抗體（1∶ 2 000）、VEGF抗體（1∶3 000）及β-actin抗體（1∶900）4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌后以相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL法顯影并用CCD相機(jī)拍照，采用UVP Software軟件分析。以β-actin 作為內(nèi)部參照。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各實驗數(shù)據(jù)均以（x-±s）表示，組間差異采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)比較

由圖1-A和圖1-B對比可見，對照組心肌細(xì)胞排列有序、致密，而實驗組心肌細(xì)胞排列紊亂，且較為稀疏，部分肌原纖維扭曲甚至斷裂。

2.2 兩組大鼠心肌組織中HIF-1α、VEGF表達(dá)水平的比較

圖2、圖3分別表示通過免疫組化染色觀察HIF-1α、VEGF在兩組大鼠心肌組織中的表達(dá)情況，圖中棕黃色顆粒為所標(biāo)記目的蛋白。如圖所示，實驗組HIF-1α表達(dá)水平高于其在對照組中的表達(dá)水平；而實驗組VEGF的表達(dá)水平卻低于其在對照組中的表達(dá)水平。

圖4表示通過Western Blot測定的HIF-1α、VEGF在大鼠心肌組織中的表達(dá)情況。其結(jié)果與通過免疫組化法測定相一致，即：與對照組相比，實驗組HIF-1α表達(dá)水平升高[（1.00±0.20）vs.（5.67±0.86）]（t=-8.882，P＜0.05），而VEGF的表達(dá)水平降低 [（1.00±0.09）vs. （0.31±0.12）]（t=8.727，P＜ 0.05）。

圖1-A 對照組心肌組織HE染色結(jié)果

圖1-B 實驗組心肌組織HE染色結(jié)果

圖2-A 對照組心肌組織HIF-1α免疫組化染色結(jié)果

圖2-B 實驗組心肌組織HIF-1α免疫組化染色結(jié)果

圖3-A 對照組心肌組織VEGF免疫組化染色結(jié)果

圖3-B 實驗組心肌組織VEGF免疫組化染色結(jié)果

3 討論

本研究得出以下結(jié)論：吸煙促使大鼠心肌損傷，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列紊亂、肌原纖維扭曲斷裂；同時，吸煙可以上調(diào)大鼠心肌組織中HIF-1α表達(dá)并下調(diào)VEGF表達(dá)，提示吸煙有可能通過此途徑損傷心肌。

吸煙對心血管系統(tǒng)危害甚大，有文獻(xiàn)報道，長期大量吸煙者副交感神經(jīng)張力明顯降低[5]，減弱其對交感神經(jīng)興奮的拮抗作用，同時香煙中的尼古丁成分亦可興奮交感神經(jīng)。因此，吸煙可以引起交感神經(jīng)興奮性增高，導(dǎo)致吸煙者心率增快、心肌收縮力增強(qiáng)、動脈收縮，從而使得心肌耗氧量增加、心肌供氧量不足，心肌處于缺氧狀態(tài)。此外，吸煙后人體血液中COHb增加，COHb增多使Hb運(yùn)輸氧的能力減低，進(jìn)一步加重了心肌缺氧[6]。缺氧環(huán)境使HIF-1α激活[7]，進(jìn)而表現(xiàn)為HIF-1α表達(dá)增加。HIF-1的表達(dá)與活性除了主要受細(xì)胞氧濃度調(diào)節(jié)外，還受到其他一些重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)，如PI3K及ERK/MAPL途徑等[8]。吸煙是否影響了除細(xì)胞氧濃度外的其它途徑，仍需進(jìn)一步研究。

HIF-1表達(dá)增加是缺氧早期首發(fā)的分子水平的適應(yīng)性反應(yīng)，通過作用于靶基因，參與血管再生、紅細(xì)胞生成、凋亡、細(xì)胞分化、糖代謝、pH值調(diào)節(jié)等。VEGF基因是受HIF-1α調(diào)控的重要靶基因之一，在VEGF 5’端增強(qiáng)子內(nèi)存在HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)，缺氧能夠激活HIF-1αDNA結(jié)合活性，HIF-1α與VEGF 5’端增強(qiáng)子結(jié)合后使VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增強(qiáng)[9]。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂原，是最重要的促血管形成的誘導(dǎo)因子之一[10]。已有臨床研究提示，心肌缺血缺氧越重，血清HIF-1α與VEGF的表達(dá)水平越高，且考慮VEGF表達(dá)增加受HIF-1α表達(dá)增加的激活與調(diào)控[11]。而在本研究中，煙熏大鼠心肌中VEGF的表達(dá)水平并未隨HIF-1α的表達(dá)增加而增加，反而明顯降低。國內(nèi)外研究表明，吸煙抑制冠脈側(cè)支循環(huán)的形成。由于VEGF的作用是促進(jìn)新生血管形成，因此，我們認(rèn)為吸煙可能通過抑制VEGF的表達(dá)而影響了冠脈側(cè)支循環(huán)的形成。在這種情況下，缺血缺氧心肌無法有效形成新生血管，不能對缺血缺氧產(chǎn)生代償性適應(yīng)，進(jìn)一步加重心肌損傷。

綜上，吸煙引起心肌損傷，為適應(yīng)吸煙導(dǎo)致的心肌缺氧，心肌中HIF-1α的表達(dá)上調(diào)，但吸煙通過抑制VEGF的表達(dá)影響了冠脈側(cè)支循環(huán)的形成，加重對心血管系統(tǒng)的危害。已有臨床試驗表明[12]，經(jīng)冠狀動脈注射重組人血管內(nèi)皮生長因子可使心肌血流量呈劑量依賴性改善。心肌供血量的增加能夠緩解心肌缺血缺氧狀態(tài)，進(jìn)而改善冠心病患者預(yù)后。因此，有關(guān)VEGF的進(jìn)一步研究將為具有長期大量吸煙史的冠心病患者的治療提供了新的途徑。

[1] 董華，翟鳳燕． 冠心病吸煙患者臨床及冠狀動脈特點(diǎn)研究[J]． 實用心腦肺血管病雜志，2014，22（2）：54-55．

[2] Taniguchi CM，Miao YR，Diep AN，et al． PHD inhibition mitigates and protects against radiationinduced gastrointestinal toxicity via HIF2[J]． Sci Transl Med，2014，6（236）：236-264．

[3] 邢英琦，徐靜，李琳，等． 缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)與靶基因研究進(jìn)展[J]． 中國實驗診斷學(xué)，2011，15（1）：177-179．

[4] 李少榮，胡曉繼． 血管內(nèi)皮生長因子基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥 [J]． 華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2016，30（1）：75-78．

[5] 王一春，劉洵，劉博淼，等． 吸煙對老年男性冠心病患者自主神經(jīng)功能康復(fù)的影響[J]． 中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（7）：667-671．

[6] 張俊美 ． 吸煙與心血管疾病 [J]． 大家健康（中旬版），2014，8（1）：34-35．

[7] Schodel J， Mole DR，Ratcliffe PJ． Pan-genomic binding of hypoxiainducible transcription factors[J]． Biol Chem，2013，394（4）：507-517．

[8] 李繼強(qiáng)，陳謙學(xué)． 缺氧誘導(dǎo)因子1α相關(guān)信號通路與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展 [J]． 醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（24）：4460-4464．

[9] 姜桐，劉方琮，蔡麗瑛． 缺氧誘導(dǎo)因子-1和血管內(nèi)皮生長因子及其受體家族對妊娠期高血壓疾病發(fā)生的研究進(jìn)展[J]． 中華地方病學(xué)雜志，2016，35（3）：231-234．

[10] Li Y，F(xiàn)u SY，Wang LH，et al． Copper improves the antiangiogenic activity of disulfiram through the EGFR/Src/VEGF pathway in gliomas[J]． Cancer Lett，2015，369（1）：86-96．

[11] 程景林，萬俊，王愛玲． 冠心病患者缺氧誘導(dǎo)因子-1α與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的關(guān)系[J]． 山東醫(yī)藥，2012，52（5）：13-15．

[12] Henry TD，Rocha-Singh K，Isner JM，et al． Intracoronary administration of recombinant human vascular endothelial growth factor to patients with coronary artery disease[J]． Am Heart J， 2001，142（5）：872-880．

The Expression of Hypoxia-Inducible Factor-1α and Vascular Endothelial Growth Factor in Cardiac Muscle Tissue of Smoked Rats

LIU Yang1 YAN Rui2 LI Xiangting1 1 Department of Internal Medicine,Affiliated Hospital of Ji’ning Medical College, Ji’ning Shandong 272100,China; 2 Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiao Tong University, Xi'an Shanxi 710004, China

ObjectiveTo explore the expression of hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in cardiac muscle tissue of smoked rats, and to discuss the effect of smoking on muscle tissue of rats and possible mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into control group and experimental group, and experimental group was intervened by smoking. After 8 weeks, cardiac muscle tissue of rats was observed in morphology, and the expression of HIF-1α and VEGF were explored through immunohistochemical technique and Western Blot.ResultsCompared with control group, cardiac muscle tissue of smoked rats was arranged in disorder and sparsely, and some muscle fibril was twisty and even fractured. The expression of HIF-1α in experimental group was higher than it in control group, but the expression of VEGF in experimental group was lower than it in control group.ConclusionSmoking may damage cardiac muscle tissue of rats through increasing the expression of HIF-1α and lowering the expression of VEGF.

smoked; cardiac muscle tissue; hypoxia-inducible factor-1α;vascular endothelial growth factor

R3

A

1674-9316（2017）21-0132-05

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．21．069

國家自然科學(xué)基金面上項目（81570382）

1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)一科，山東 濟(jì)寧 272100；2 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710004

李祥廷