依香叫，王松月，李金誠(chéng)，燕夢(mèng)云，裴凌鵬

(中央民族大學(xué)，北京 100081)

【方藥研究】

刺老苞根皮含藥血清對(duì)原代成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能的影響?

依香叫，王松月，李金誠(chéng)，燕夢(mèng)云，裴凌鵬△

(中央民族大學(xué)，北京 100081)

目的：研究不同濃度刺老苞根皮含藥血清對(duì)原代成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化功能的影響。方法：SPF級(jí)健康雌性SD 大鼠(80 只)給予蒸餾水、刺老苞根皮水煎劑高、中、低3種劑量濃度，連續(xù)灌胃7 d制備含藥血清。各組含藥血清干預(yù)培養(yǎng)成骨細(xì)胞，采用微量酶標(biāo)法檢測(cè)堿性磷酸酶活性、茜素紅染色鈣化結(jié)節(jié)并計(jì)數(shù)，流式PI單染法檢測(cè)成骨細(xì)胞周期。結(jié)果：在干預(yù)培養(yǎng)后與模型對(duì)照組比較，各劑量組堿性磷酸酶活性、鈣化結(jié)節(jié)數(shù)有所升高，中、高劑量組高于模型對(duì)照組；與模型對(duì)照組比較，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各劑量組G0/G1期、G2/M期明顯下降，S期和G2/M+S期明顯升高。結(jié)論：刺老苞根皮含藥血清可通過(guò)延長(zhǎng)原代成骨細(xì)胞S期，促進(jìn)其增殖、分化及礦化功能的作用。

刺老苞根皮；原代成骨細(xì)胞；堿性磷酸酶；礦化結(jié)節(jié)；成骨細(xì)胞周期

土家族藥刺老苞根皮為五加科楤木屬植物楤木(Aralia echinocaulis Hand.Mazz)及其變種白背葉楤木(Aralia chinensis L. var.nuda Nakai)的根皮或莖皮，藥材片狀或槽狀，氣微香，嚼之帶黏液性，味辛性平，歸肝腎經(jīng)，功能滋陰補(bǔ)腎、祛風(fēng)濕、壯筋骨、散瘀血、消腫毒，可用于風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、骨折等治療[1-3]。經(jīng)大量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)證明，刺老苞根皮能促進(jìn)骨折愈合[5-9]?，F(xiàn)通過(guò)刺老苞根皮含藥血清干預(yù)原代成骨細(xì)胞來(lái)觀(guān)察其對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及功能的影響，以進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24 h SD大鼠乳鼠10只。SPF級(jí)健康雌性SD 大鼠80 只，3 月齡，體質(zhì)量(270±20) g，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK-(軍)2012-0004)。

1.2 藥物

刺老苞根皮采于湖北恩施地區(qū)(經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系楊瑤珺教授鑒定，批號(hào)0P1101)，湖北恩施中藥材有限公司。

1.3 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液(美國(guó)Gibco)，青霉素/鏈霉素、茜素紅、II 型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸(美國(guó)Sigma)，PBS 磷酸鹽緩沖液(粉劑，北京昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，堿性磷酸酶試劑盒(微量酶標(biāo)法，南京建成科技公司)，PI/RNase Staining Buffer(美國(guó)BD Pharmingen公司)。

1.4 主要儀器

細(xì)胞超凈操作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)，電腦型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

2 方法

2.1 刺老苞根皮含藥血清制備與分組

2.1.1 刺老苞根皮含藥血清制備 SPF級(jí)健康雌性SD大鼠80 只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，通過(guò)在脛骨上打孔模擬骨折二期愈合的理想力學(xué)環(huán)境。術(shù)后第2天用SPSS軟件按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、刺老苞根皮低劑量組、刺老苞根皮中劑量組、刺老苞根皮高劑量組4組各20只。用藥劑量根據(jù)人體習(xí)用安全劑量(20 g·70 kg-1)，按人/鼠表面積比率換算等效計(jì)量法計(jì)算。刺老苞根皮灌胃劑量為1.8 g·kg-1·d-1，以臨床劑量為中劑量，1/2、2倍劑量為低、高劑量(即分別為0.9 g·kg-1·d-1、3.6 g·kg-1·d-1)。模型組給予等劑量等頻率蒸餾水，術(shù)后7 d取材(取材前進(jìn)食12 h)，末次給藥后1 h稱(chēng)重，3%戊巴比妥鈉(3 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，在無(wú)菌操作下腹主動(dòng)脈采血，將采集來(lái)的血樣在室溫下靜置2 h后，1800 r·min-1離心20 min，分離出血清，56 ℃水浴滅活30 min，在0.22 μm微孔膜過(guò)濾除菌后分裝，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 分組 實(shí)驗(yàn)共分為4組：模型對(duì)照組(20% 模型對(duì)照組大鼠血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)、低劑量組(20% 刺老苞低劑量含藥血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)、中劑量組(20% 刺老苞中劑量含藥血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)、高劑量組(20% 刺老苞高劑量含藥血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)。

2.2 原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

取新生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠10只，放入75%乙醇浸洗乳鼠，將乳鼠轉(zhuǎn)移到一個(gè)有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)，在無(wú)菌操作下分離顱骨，清除顱骨表面的結(jié)締組織，用PBS簡(jiǎn)單沖洗顱蓋骨后放入15 mL離心管內(nèi)，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶液-II型膠原酶溶液(1∶2)(消化液)，37 ℃恒溫水浴振蕩消化5 min棄上清液。加入3 mL消化液，37 ℃恒溫水浴振蕩消化10 min，收集上清液并重復(fù)消化4次。將收集的消化液1500 r·min-1離心4 min棄上清液，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)24 h后，換成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(10% FBS+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)，每3 d換液1次，待細(xì)胞融合50%～70%后消化并傳代，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)ALP(alkaline phosphatase堿性磷酸酶)染色和茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞。

2.3 微量酶標(biāo)法堿性磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)

收集第3代原代成骨細(xì)胞，以1×105個(gè)·mL-1接種于24孔板，每孔1 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每2 d換液1次，并每天觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)48 h后按實(shí)驗(yàn)分組更換不同含藥血清培養(yǎng)基。分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h用微量酶標(biāo)法檢測(cè)ALP活性(參照堿性磷酸酶微量酶標(biāo)法說(shuō)明書(shū)操作)。

2.4 茜素紅染色法檢測(cè)細(xì)胞礦化功能實(shí)驗(yàn)

收集第3代原代成骨細(xì)胞，以1×105個(gè)·mL-1接種于24孔板，每孔1 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每2 d換液1次，并每天觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)48 h后按實(shí)驗(yàn)分組更換不同含藥血清培養(yǎng)基，10 d后取出24孔板，用PBS沖洗3遍，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水沖洗3遍，每孔加入2 mL茜素紅染液，放置于37 ℃、45 min后蒸餾水沖洗3遍，用熒光倒置顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量。

2.5 流式PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

收集第3代原代成骨細(xì)胞，以1×105個(gè)·mL-1接種于6孔板，每孔2 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每天觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)48 h后按實(shí)驗(yàn)分組更換不同含藥血清培養(yǎng)基，干預(yù)培養(yǎng)48 h后，0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS(1×)沖洗2遍后，邊振蕩邊加預(yù)冷70%乙醇，存放于4 ℃、24 h后加入PI/RNase Staining Buffer染液0.5 mL，室溫下孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 原代成骨細(xì)胞的鑒定結(jié)果

圖1顯示，原代成骨細(xì)胞用成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)倒置顯微鏡觀(guān)察，細(xì)胞在24 h后開(kāi)始貼壁，48 h后完全貼壁，細(xì)胞為單核，呈長(zhǎng)梭形和多角形等形態(tài)，10 d左右細(xì)胞融合成鋪路石樣，并伴有礦化結(jié)節(jié)的出現(xiàn)。

3.2 堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果

表1顯示，不同濃度刺老苞根皮含藥血清在0～96 h期間干預(yù)成骨細(xì)胞并用微量酶標(biāo)法檢測(cè)ALP活力。結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，48 h、72 h中劑量組ALP活力高于模型對(duì)照組(P<0.05)，96 h中劑量組ALP活性明顯升高(P<0.01)，48～96 h高劑量組ALP活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

組別例數(shù)ALP(金氏單位/100ml)0h24h48h72h96h對(duì)照組30.095±0.0060.102±0.0100.169±0.0120.201±0.01500.231±0.014低劑量組30.095±0.0060.109±0.0140.198±0.0150.235±0.01700.269±0.020中劑量組30.095±0.0060.121±0.0170.279±0.017*0.328±0.0180*0.391±0.020**高劑量組30.095±0.0060.124±0.0160.339±0.017**0.398±0.1020**0.433±0.023**

注：與模型對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.3 成骨細(xì)胞礦化功能檢測(cè)結(jié)果

表2顯示，不同濃度含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞作用10 d后，經(jīng)茜素紅染色后計(jì)數(shù)鈣化結(jié)節(jié)的個(gè)數(shù)。結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，低劑量組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)增多且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中劑量組和高劑量組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)明顯增多且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 不同濃度含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 不同濃度含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞周期的影響

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01

3.4 成骨細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

表3顯示，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期G0/G1期與模型對(duì)照組比較，各劑量組都有不同程度的降低，其中中劑量組、高劑量組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期G2/M期與模型對(duì)照組比較，各劑量組均有所降低，其中中劑量組、高劑量組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期S期與模型對(duì)照組比較，各劑量組均有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；成骨細(xì)胞的細(xì)胞軸系G2/M+S期與模型對(duì)照組比較，各劑量組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

4 討論

土家族是我國(guó)的主要少數(shù)民族之一，主要分布于我國(guó)黔、湘、渝、鄂相鄰的武陵山、大婁山、大巴山、巫山余脈，這些地區(qū)地勢(shì)險(xiǎn)峻陡峭、崎嶇不平，給土家族人民的生產(chǎn)生活帶來(lái)極大的不便，加之以前戰(zhàn)事頻繁，常有毒蛇出沒(méi)，造成金創(chuàng)、骨折外傷出現(xiàn)較多，使土家醫(yī)在骨傷科疾病的治療用藥方面積累了大量的寶貴經(jīng)驗(yàn)。土家醫(yī)經(jīng)長(zhǎng)期的醫(yī)療實(shí)踐，形成了土家族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論體系，其醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ)是“三元”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為骨折后如經(jīng)脈暢通，氣、血、精充分滋養(yǎng)，頭元、腹元、足元調(diào)和方能愈合[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨折愈合的基礎(chǔ)是骨膜成骨細(xì)胞再生，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程[4]，故成骨細(xì)胞在骨折愈合中起重要作用。成骨細(xì)胞是一種典型的分泌細(xì)胞，其胞漿膜上富含堿性磷酸酶。堿性磷酸酶可調(diào)節(jié)骨基質(zhì)成熟穩(wěn)定，是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)。經(jīng)前期研究民族藥刺老苞根皮對(duì)骨折愈合的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，刺老苞根皮含有較高的總黃酮、總皂苷、多糖和豐富的微量元素，能夠提高大鼠骨組織內(nèi) Ca、 Mg、 P、 Mn、 Cu、 Se、 Zn 等礦物元素的含量，升高骨堿性磷酸酶轉(zhuǎn)移酶(ALP)、骨鈣素、羥脯氨基酸、骨磷含量，改善脛骨骨折大鼠骨代謝情況，有效促進(jìn)骨折愈合修復(fù)[5-9]。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用混合酶消化法多次消化乳鼠顱蓋骨獲得成骨細(xì)胞的方法培養(yǎng)獲得成骨細(xì)胞，同時(shí)利用ALP染色和鈣茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞，并取3～6代成骨細(xì)胞為研究對(duì)象。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，刺老苞根皮含藥血清通過(guò)延遲S期(DNA的合成期)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)其礦化的能力，從而促進(jìn)骨折愈合。但刺老苞根皮含藥血清調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖、分化的作用機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步探究。

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EffectofAraliaEchinocauiisHand.MazzContainingSerumonProliferation,Differentiation,MineralizationofPrimaryOsteoblasts

YI Xiang-jiao, WANG Song-yue, LI Jin-cheng, YAN Meng-yun, PEI Ling-peng△

(MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objectives:Observing the influence of Aralia echinocauIis Hand.Mazz containing serum on the proliferation, differentiation, mineralization of primary osteoblasts. Methods: SD rats (n=80) were used to make Aralia echinocauIis Hand.Mazz containing serum by gastric perfusion for seven days with distilled water, Aralia echinocauIis Hand.Mazz water decoction high, middle, low dosages. In vitro, the primary osteoblasts were cultured with the drug serum in each group. Detection of alkaline phosphatase activity by trace enzyme method, cells were detected by alizarin red staining experiments, osteoblasts cycle were analyzed by flow cytometry. Results: After osteoblasts were intervened with the serum in each group, compared with model groups, osteoblasts were cultured with drug serum in each group, the alkaline phosphatase activity and the ability of mineralization were improved. The G0/ G1and G2/M phase of the osteoblasts cycle were decreased. The S and G2/M+S phase were increased. Conclusion: Effects of Aralia echinocaulis Hand.Mazz containing serum could extend the S phase of osteoblasts. The proliferation, differentiation, mineralization of primary osteoblasts were promoted.

Aralia echinocauIis Hand. Mazz; Primary osteoblast; Alkaline phosphatase; Mineralization; Osteoblasts cycle

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1305-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81673769)-基于信號(hào)網(wǎng)絡(luò)耦聯(lián)節(jié)點(diǎn)理論探討刺老苞根皮有效成分群干預(yù)糖尿病骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制研究;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473451)-基于3D打印技術(shù)與分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)理論研究刺老苞根皮有效成分群調(diào)控骨折愈合作用機(jī)制；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81270051)-基于Wnt/β-catenin與TGF-β/BMPs信號(hào)耦聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的刺老苞根皮干預(yù)骨折愈合分子機(jī)制研究；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(IRT-13R63)-中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)

依香叫(1988-)，女(傣族)，云南人，在讀博士，從事民族醫(yī)藥學(xué)研究。

裴凌鵬(1976-)，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，從事民族醫(yī)藥與臨床學(xué)研究，E-mail: lppei@hotmail.com。

2017-04-05