肖 燕，張皓然，陳 昊，顧一煌，洪漢青

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

【針灸研究】

電針對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠口服雷公藤甲素藥動(dòng)學(xué)及肝損指標(biāo)的影響?

肖 燕，張皓然，陳 昊，顧一煌△，洪漢青

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

目的：為電針聯(lián)合雷公藤甲素(triptolide，TPL)治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)，同時(shí)減輕TPL所致的肝損提供增效減毒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：RA模型采用弗氏完全佐劑(freund’s complete adjuvant，CFA)建立，運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)檢測(cè)大鼠血漿TPL濃度，試劑盒測(cè)定肝勻漿中谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)活性。結(jié)果：針?biāo)幗M大鼠足趾腫脹改善情況最好，藥物組次之，再者為電針組；在同一時(shí)刻電針刺“足三里”后的血藥濃度高于單獨(dú)口服TPL的濃度，TPL的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：達(dá)峰時(shí)間(Tmax)提前，峰濃度(Cmax)及藥時(shí)曲線下面積(area under the curve，AUC)提高；針?biāo)幗MALT、AST含量及MDA活性均較藥物組降低，SOD活性則升高。結(jié)論：電針“足三里”可以減輕RA大鼠足趾腫脹，提高TPL的血藥濃度，進(jìn)而提高其生物利用度，同時(shí)還可減輕TPL對(duì)RA大鼠肝組織的損傷，提高其抗氧化應(yīng)激能力。

電針；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；雷公藤甲素；藥動(dòng)學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因未明、慢性進(jìn)行性、侵蝕性的全身性疾病，以關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周?chē)M織非化膿性炎癥為主要表現(xiàn)，其早期治療至關(guān)重要[1]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，TPL在抑制免疫炎癥反應(yīng)、抗腫瘤和抗生育等方面發(fā)揮著重要作用[2]，但TPL中毒劑量和有效劑量非常接近[3]，因此其應(yīng)用受到極大限制。本研究旨在探討電針對(duì)RA大鼠口服TPL的藥動(dòng)學(xué)及TPL致RA大鼠肝損傷的ALT、AST、MDA指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)SOD的影響，為電針結(jié)合TPL治療RA及同時(shí)減輕TPL所致的肝損提供增效減毒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物造模及分組 7周齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20) g共50只，購(gòu)自上海斯萊特實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(動(dòng)物許可證號(hào)2007000523799)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只作為空白對(duì)照，另40只根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4]，取經(jīng)消毒后的左側(cè)后肢足墊皮內(nèi)注射0.l ml CFA建造RA模型。按隨機(jī)數(shù)字表法將RA大鼠分為模型組、電針組、藥物組和針?biāo)幗M各10只，飼養(yǎng)室溫為20～25 ℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%。

1.1.2 主要試劑及儀器 CFA由Sigma公司提供(生產(chǎn)批號(hào)F5881)；YLS-7B足趾容積測(cè)量?jī)x由河北邢臺(tái)潤(rùn)聯(lián)科技開(kāi)發(fā)有限公司提供；潑尼松龍標(biāo)準(zhǔn)品、TPL標(biāo)準(zhǔn)品由上?；菡\(chéng)生物科技有限公司提供；乙酸銨、甲酸、甲醇及乙酸乙酯由南京化學(xué)試劑有限公司提供；5810R冷凍離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf生產(chǎn)，上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司提供；SHIMADZΜ LC-20A高效液相色譜儀:LC-20AD泵2個(gè)、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A控制器由日本島津液相色譜儀公司提供；4000 Q TRAP質(zhì)譜儀由美國(guó)AB Sciex公司提供；AST、ALT測(cè)定試劑盒由世諾臨床診斷制品上海貿(mào)易有限公司供給(生產(chǎn)批號(hào)J022、J027)；MDA、SOD測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所供給(生產(chǎn)批號(hào)20150915、20150918)。

圖1 大鼠血漿中雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2 方法

1.2.1 足趾體積測(cè)量 采用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量RA大鼠足趾體積。具體操作：自大鼠踝關(guān)節(jié)上畫(huà)一標(biāo)記線，以該線為標(biāo)記，將大鼠足趾沒(méi)入水中，水平面與該線平齊，測(cè)量足趾體積。每只大鼠每個(gè)足趾分別由2人各測(cè)量2次，取平均值記錄數(shù)據(jù)，連續(xù)觀察4周。

1.2.2 干預(yù)方法 用自制的鼠架俯臥位固定電針組大鼠，用0.25 mm×25 mm華佗牌毫針針刺雙側(cè)“足三里”(取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5])，進(jìn)針直刺2～3 mm，平補(bǔ)平瀉1 min，將電針儀的導(dǎo)線接到針柄上，給予連續(xù)波刺激(頻率為1 Hz/s)，強(qiáng)度1～2 mA(以雙下肢輕微抖動(dòng)為度)，每天1次，每次20 min，電針干預(yù)結(jié)束后給予0.9%氯化鈉水溶液(1.17×10-2mol/L)灌胃；藥物組每天給予等量的TPL溶液(7.208×10-2mol/L)灌胃；針?biāo)幗M先給予與電針組相同的電針刺激，再給予同藥物組等量的TPL溶液灌胃。于同一時(shí)間給予空白組、模型組以與其他組相同方式的抓取固定,并給予等量0.9%氯化鈉水溶液灌胃，共干預(yù)14 d。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)條件 參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]設(shè)立高效液相色譜-質(zhì)譜條件，色譜條件為色譜柱：Thermo BDS HYPERSIL C18(100 mm×2.1 mm, 2.4 μm)Part No. 28102-102130，45 ℃柱溫，流動(dòng)相：2 mmoL乙酸銨+0.5‰，甲酸∶甲醇(VV=55∶45)，流速為0.2 mL/min；質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(Turbo Spray)，多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)，正離子模式，Turbo Gas Temperature(TEM)：550 ℃；Auxiliary Gas(GS2)：30 psi，Nebulizing Gas(GS1)：30 psi，Curtain Gas(CUR)：10 psi，Ion Spray Voltage(IS)：5500 V。

1.2.4 樣品采集與處理 分別于給藥后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、360 min采集藥物組和針?biāo)幗M大鼠的眼眶靜脈血。將10 μL內(nèi)標(biāo)液(7.2088×10-7mol/L潑尼松龍)加入100 μL空白大鼠血漿中，渦旋30 s混勻，加入1ml乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，以轉(zhuǎn)速為12000 r/min(rcf)在高速冷凍離心機(jī)離心10 min，4℃取800 μL上清液真空濃縮揮干，用100 μl流動(dòng)相溶解，以20000 rcf的轉(zhuǎn)速在高速冷凍離心機(jī)離心10 min，取60 μL上清液，20 μL進(jìn)樣進(jìn)行LC-MS分析。將色譜峰面積代入回歸方程，即求得各時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中的TPL濃度。

1.2.5 線性關(guān)系考察 圖1顯示，將7.2088×10-7mol/L的潑尼松龍10 μL加入100 μL大鼠空白血漿中，再分別加入濃度為9.01×10-11、1.802×10-10、3.604×10-10、1.802×10-9、7.208×10-9、1.802×10-8mol/L的TPL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，按上述“1.2.4”項(xiàng)方法操作，每個(gè)濃度取樣5份，分析并記錄樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰面積，用樣品濃度C對(duì)樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值A(chǔ)作線性回歸，得回歸方程y=0.0785x+0.0361，r=0.9969(權(quán)重W=1/C2)，TPL在9.01×10-11-1.802×10-8mol/L濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.2.6 日內(nèi)與日間精密度 表1顯示，將空白血漿分別配制3個(gè)不同濃度(0.5、5、40 ng/ml)的質(zhì)量監(jiān)控樣品，每個(gè)濃度取樣5份，共分析3個(gè)批次，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批依法進(jìn)行測(cè)定，以同批標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度及批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果表明日間精密度和日內(nèi)精密度變異均小于5%。

1.2.7 提取回收率及樣品穩(wěn)定性考察 表2顯示，各取5份上述不同濃度的樣品，將空白樣品中添加被測(cè)物并經(jīng)樣品處理后的檢測(cè)信號(hào)與血漿處理后加藥相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)液的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算得3個(gè)濃度的提取回收率分別為(94.2%±1.7、97.3%±4.1、89.7%±4.5)。仍取上述樣品各5份，在室溫穩(wěn)定性、長(zhǎng)期及凍融的不同條件下觀察其穩(wěn)定性，結(jié)果表明在-20 ℃下保存30 d、室溫放置24 h及反復(fù)凍融3次的條件下，大鼠血漿中的TPL都具有良好的穩(wěn)定性(RSD<15%)。

表1 TPL在大鼠血漿中日間、日內(nèi)精密度比較

表2 TPL在大鼠血漿中的短期、室溫和凍融穩(wěn)定性

1.2.8 肝標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè) 處死大鼠，取肝組織置于-80 ℃冰箱中保存，制備勻漿液，采取酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Elisa)測(cè)定肝組織勻漿中ALT、AST含量及SOD、MDA活性，均嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)定操作。

2 結(jié)果

2.1 足趾體積

表3顯示，足趾體積反映了RA大鼠的足趾病變程度。

表3 各組大鼠足趾體積比較

注：與模型組比較：*P<0.05；與電針組比較：ΔP<0.05；與藥物組比較：■P<0.05

表3顯示,各組大鼠足趾體積治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明各組足趾腫脹程度具有可比性。治療14 d后，電針組、藥物組、針?biāo)幗M的足趾體積與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，針?biāo)幗M與電針組、藥物組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明藥物組、電針組及針?biāo)幗M的足趾腫脹程度均較模型組減輕，且療效最好的為針?biāo)幗M，藥物組次之，再次為電針組。

2.2 各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度

表4顯示，干預(yù)14 d后按“樣品采集與處理”中的方法取各時(shí)刻大鼠血漿，通過(guò)LC-MS測(cè)得給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度如下。

表4顯示，TPL在大鼠體內(nèi)吸收較快，藥物組在給藥后10 min左右出現(xiàn)吸收峰，而針?biāo)幗M在給藥后5 min左右出現(xiàn)吸收峰，2組120 min時(shí)血藥濃度均低于檢測(cè)低限。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，藥物組和針?biāo)幗M各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。可得出結(jié)論，針?biāo)幗M在上述各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度高于藥物組，電針提高了RA大鼠體內(nèi)的血TPL濃度。

表4 藥物組和針?biāo)幗M各時(shí)間點(diǎn)血TPL濃度比較

注：與藥物組比較:*P<0.05(NA為低于檢測(cè)低限)

2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表5圖2顯示，運(yùn)用DAS2.0計(jì)算得出藥物組和針?biāo)幗M的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并繪制出AUC。

表5 藥物組和針?biāo)幗M藥動(dòng)學(xué)指標(biāo)

注：與藥物組比較：*P<0.05

圖2 藥物組和針?biāo)幗MTPL的AUC比較

表5圖2顯示，藥物組和針?biāo)幗M的AUC變化趨勢(shì)大體相似，在10 min即達(dá)到Cmax，初始血TPL濃度急驟下降，而后速度減緩，360 min后低于檢測(cè)低限。經(jīng)DAS2.0分析，電針可以影響TPL在模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程：(1)經(jīng)LC-MS檢測(cè)，電針“足三里”后的血TPL濃度在同一時(shí)間點(diǎn)高于單獨(dú)口服TPL的濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明電針可提高同一時(shí)間點(diǎn)的血漿TPL濃度；(2)電針“足三里”提前了TPL的Tmax，并提高其Cmax及AUC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明電針可提高單位時(shí)間血TPL濃度，進(jìn)而提高其生物利用度。

2.4 ALT、AST含量和SOD、MDA活性

表6顯示，針?biāo)幗M肝組織勻漿液中的ALT、AST含量及MDA活性均較藥物組降低，而SOD活性則升高(P<0.05)。

表6 藥物組與針?biāo)幗MALT、AST含量及SOD、MDA活性比較

注：與藥物組比較:*P<0.05

3 討論

現(xiàn)代研究表明，電針聯(lián)合藥物能夠在一定程度上拮抗藥物毒副作用，提高藥物生物利用度，促進(jìn)藥物的靶向運(yùn)動(dòng)，電針能很好地減輕RA的免疫炎癥反應(yīng)，并能一定程度地抑制TPL對(duì)RA的肝毒性。

本研究顯示，針?biāo)幗M大鼠足趾腫脹改善情況最好，且電針提升單位時(shí)間血TPL濃度、Cmax及AUC，提升TPL的生物利用度，其機(jī)制可能與電針增強(qiáng)胃電活動(dòng)[7]或調(diào)控RA的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路[8]有關(guān)，這可作為今后進(jìn)一步研究的切入點(diǎn)。此外，電針還降低肝組織的ALT、AST含量及MDA活性，升高SOD活性，說(shuō)明電針減輕TPL所致的肝損害，有助于肝功能恢復(fù)[9]和提高肝組織的抗氧化能力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也對(duì)臨床電針結(jié)合TPL治療RA提供了參考性意義，即在臨床治療RA時(shí)可將電針與低劑量TPL“足三里”配合干預(yù)，提高TPL的生物利用度，節(jié)省藥物成本；另一方面也提示，TPL劑量應(yīng)用較大時(shí)需慎用電針，以防電針引起血TPL濃度過(guò)高而對(duì)機(jī)體肝、腎、心等多個(gè)臟器造成毒性損害。本研究結(jié)果為動(dòng)物藥理學(xué)和毒理學(xué)研究及針?biāo)幗Y(jié)合治療RA的安全性和有效性(最佳給藥途徑、給藥間隔時(shí)間)提供重要的理論依據(jù)，但存在分組較少、動(dòng)物樣本量不足、實(shí)驗(yàn)過(guò)程欠規(guī)范化、穴位選擇及操作手法差異性等不足。故實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)服務(wù)于臨床，針對(duì)“足三里”的臨床功效還需進(jìn)一步深入研究，通過(guò)對(duì)比觀察不同穴位的療效，從而為電針結(jié)合TPL治療RA開(kāi)辟一條新的增效減毒路徑。

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ImpactsofPharmacokineticsandLiverDamageIndexesofElectroacupunctureonRheumatoidArthritisRatswithTakingTriptolideOrally

XIAO Yan, ZHANG Hao-ran, CHEN Hao, GU Yi-huang△, HONG Han-Qing

(SecondClinicalMedicalSchool,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective: Observe the effect of electro-acupuncture combined with triptolide(TPL)on the digits swelling of rheumatoid arthritis(RA) rats, and influence of electroacupuncture to pharmacokinetic parameters and Liver damage indexes: aspartate aminotrans ferase(ALT)、aspartate aminotransferase(AST)、superoxide dismutase(SOD)、malondialdehyde(MDA) of RA rats with taking TPL orally, which displays the effects of efficacy enhancing and toxicity reducing for TPL-induced liver injury and provides experimental basis for clinical RA treatment of electroacupuncture combined with TPL. Methods:Building RA rats by using freund’s complete adjuvant(FCA);Using liquid chromatography-mass spectrometry to detect the TPL concentration in the plasma, and liver homogenate was prepared to detect the content of ALT、AST and the activity of SOD and MDA by enzyme-linked immuno sorbent assay (Elisa) kit. Results:The improvement situation of digits swelling of RA rats in the electroacupuncture combined with TPL group was best, the drug group followed, and electroacupuncture group came in last;TPL’s concentration in the electroacupuncture combined with TPL group was higher than that in the drug group at the same time, Tmaxin advance, the peak concentration(Cmax) of TPL and area under the curve(AUC) increased, too;Combined with drug group, the content of ALT、AST and the activity of MDA in the electroacupuncture combined with TPL group decreased, the activity of SOD increased. Conclusions: Electroacupuncture at “Zusanli(ST36)” not only can alleviate the digits swelling of RA rats, improve the blood TPL concentration and bioavailability, but also can reduce the liver injury of RA rats caused by oral TPL, and improve the organic ability to resist oxidative stress.

Electroacupuncture; Rheumatoid arthritis(RA); Triptolide(TPL); Pharmacokinetics; Liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)

R245.9+7

B

1006-3250(2017)09-1284-04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81674063)-不同時(shí)間窗電針干預(yù)抗心肌缺血再灌注損傷的自噬相關(guān)機(jī)制研究;南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家基金預(yù)研基金項(xiàng)目(14XYY07)

肖 燕(1988-)，女，廣西梧州人，在讀碩士，從事艾灸對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的防治研究。

顧一煌(1965-)，男，江蘇南通人，教授，從事中醫(yī)藥對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的防治研究，Tel：025-85811683,E-mail:gyh5196411@163.com。

2017-02-10