裴玲燕，張純芳，劉偉志，柯愈詩，王 琳

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

【實(shí)驗(yàn)研究】

翻白草對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的藥效及作用機(jī)制研究?

裴玲燕，張純芳，劉偉志△，柯愈詩，王 琳

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

目的：研究翻白草對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的藥效作用，并探討翻白草治療UC的可能分子機(jī)制。方法：采用三硝基苯磺酸-乙醇灌腸法復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠模型，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、模型對照組、柳氮磺吡啶組、翻白草低、中、高劑量組6組。連續(xù)給藥14 d后水合氯醛麻醉，取病變結(jié)腸組織石蠟包埋、切片、染色后鏡下觀察，剩余結(jié)腸組織采用western blot方法分別檢測TLR4及NF-κBP65。結(jié)果：DAI指數(shù)及病理形態(tài)變化表明，與空白組比較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，翻白草低劑量組治療效果最佳；與空白組比較模型組大鼠結(jié)腸組織NF-κBP65表達(dá)水平顯著增加，翻白草給藥組均能下調(diào)NF-κBP65的表達(dá)水平。結(jié)論：翻白草能通過調(diào)控NF-κBP65表達(dá)水平以發(fā)揮對UC的治愈作用。

翻白草；潰瘍性結(jié)腸炎；藥效；TLR4；NF-κBP65

翻白草(PotentilladiscolorBunge)通常生長于海拔800～1850 m的荒地、山谷、溝邊、山坡草地、草甸及樹林，屬于薔薇科多年生草本植物，主要分布于云南、四川、陜西、東北、華北、華東和中南等地。翻白草是涼山彝族人民長期使用的一種常用藥物，在當(dāng)?shù)匾驼Z稱之為“瓦子納子”。翻白草味甘、微苦、性平，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有清火解毒、祛風(fēng)除濕、消腫止痛、涼血止血的功效，彝醫(yī)將其用于治療急慢性腹瀉、瘧疾、痢疾、瀉痢便血、風(fēng)濕痛等疾病[1]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察翻白草對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的藥效作用及對大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBP65表達(dá)水平的影響，為研究翻白草抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的機(jī)制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±10) g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK-(軍)2012-0004)，常規(guī)飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥材與試劑

翻白草采自四川涼山彝族自治州，經(jīng)中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院朱丹教授鑒定為薔薇科翻白草(PotentilladiscolorBunge)全草；柳氮磺吡啶(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)09130714)；TLR4-antibody(Santa公司，貨號(hào)sc-293072);NF-κBP65-antibody(Immunoway公司，貨號(hào)YM3111)；GAPDH鼠單抗(Immunoway公司，貨號(hào)YM3029)；三硝基苯橫酸(TNBS，sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀(BIO-TEK公司)，Elx800洗板機(jī)(BIO-TEK公司，Elx50)；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16B干燥箱(日本三洋，MIR-153型)；低溫冰箱(日本三洋，MDF-382E型)；恒溫水浴箱(江蘇太倉醫(yī)用儀器廠，DSHZ-300型)；分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，AL104型)。

2 方法

2.1 分組與模型制備

選取Wistar大鼠80只，體質(zhì)量(190～210) g，雌雄各半。腹腔注射10%水合氯醛(0.2 ml/100 g)將大鼠麻醉、固定。將外徑2.0 mm、長約15 cm的輸液管(輸液管先用液體石蠟油潤滑)，從大鼠肛門逆行插入結(jié)腸內(nèi)深約8.0 cm處，一次性將100 mg/kg TNBS和50%乙醇的TNBS/乙醇液0.25 ml注入大鼠結(jié)腸內(nèi)，用棉簽堵住大鼠肛門，輕揉大鼠腹部l min，使TNBS/乙醇液均勻地與大鼠結(jié)腸黏膜接觸。對照組用同樣方法，0.25 ml生理鹽水灌腸。3 d后隨機(jī)選取5只大鼠處死剪取直腸和結(jié)腸組織，清洗后肉眼觀察結(jié)腸組織，并取腸段(10%甲醛溶液中固定)做組織切片以確定造模是否成功。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、翻白草水煎劑高、中、低劑量組，造模成功后給予灌胃治療14 d，換算成大鼠體質(zhì)量后每日給藥量分別為翻白草水煎劑低劑量組1.6 g/kg、中劑量組3.2 g/kg、高劑量組6.4 g/kg、柳氮磺吡啶組3.6 g/kg，空白組及模型組給予溶媒灌胃。表1顯示，給藥期間對大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease active index，DAI)進(jìn)行評分。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 大鼠結(jié)腸組織病理切片制作

末次給藥后次日10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取病變部位結(jié)腸組織用4%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片，厚度為5 μm，然后進(jìn)行脫蠟和復(fù)水及蘇木精伊紅(HE)染色。

2.4 大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBP65蛋白表達(dá)檢測

動(dòng)物常規(guī)處死解剖取結(jié)腸，剪取新鮮潰瘍組織加入RIPA裂解液，低溫環(huán)境下研磨成組織勻漿液；低溫下，利用超聲波粉碎儀對組織勻漿液進(jìn)行超聲，工作10 s，間隔 30 s，30 個(gè)循環(huán)；4 ℃、10000 r·min-1離心 20 min取上清。BCA 法進(jìn)行蛋白定量后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。制備SDS-PAGE膠，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)移膜置于奶粉封閉液中封閉2 h：加一抗孵育2 h，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑發(fā)光，膠片曝光、顯影定影。掃描圖像，凝膠圖像分析軟件分析條帶積分值。以各細(xì)胞因子及其受體蛋白條帶的積分值與β-actin的比值作為蛋白表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 DAI評分

表1顯示，UC模型復(fù)制成功后，按表1進(jìn)行DAI評分。給藥第1天至第10天，模型組DAI值趨于穩(wěn)定，第11天開始模型組DAI值呈下降趨勢，說明大鼠本身具有一定自愈能力；翻白草高、中、低劑量組DAI值始終處于下降趨勢，表明翻白草對UC模型大鼠的潰瘍有較好的治療效果(圖1)。

圖1 DAI評分結(jié)果

3.2 病理學(xué)形態(tài)變化

圖2 各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)觀察

低倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組腸壁四層結(jié)構(gòu)明顯，大腸腺排列規(guī)則；模型組潰瘍明顯且潰瘍面積較大，腸壁四層結(jié)構(gòu)不明顯，其中黏膜層和黏膜下層中有豐富的炎癥細(xì)胞；陽性藥組結(jié)腸四層分層明顯，黏膜固有層、黏膜下層甚至肌層可見大量彌散淋巴細(xì)胞；高劑量組結(jié)腸四層分層明顯，大腸腺排列整齊；中劑量組結(jié)腸四層結(jié)構(gòu)分層明顯，在黏膜下層可見較大淋巴小結(jié)，大腸腺部分?jǐn)U張；低劑量組腸壁四層結(jié)構(gòu)明顯，大腸腺排列整齊，但在黏膜下層和黏膜固有層可見大量彌散的炎癥細(xì)胞。高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組腸壁黏膜層三層結(jié)構(gòu)完整；模型組結(jié)腸潰瘍處有豐富的炎癥細(xì)胞，潰瘍邊緣大腸腺排列紊亂，腺體擴(kuò)張；陽性藥組結(jié)腸大腸腺排列紊亂，腺體擴(kuò)張，黏膜固有層有較多炎癥細(xì)胞存在；高劑量組結(jié)腸黏膜層三層結(jié)構(gòu)明顯，在黏膜固有層有豐富的彌散淋巴細(xì)胞，黏膜下層可見一淋巴細(xì)胞團(tuán)存在；中劑量組結(jié)腸黏膜固有層有大量淋巴細(xì)胞存在，腺體輕度擴(kuò)張；低劑量組結(jié)腸黏膜層三層分層明顯，腺體排列整齊，但黏膜固有層和黏膜下層有許多彌散淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞存在。

3.3 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBP65蛋白表達(dá)變化

與模型組比較，空白組結(jié)腸組織NF-κBP65的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；翻白草低、中、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，柳氮磺吡啶組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，TLR4的表達(dá)與各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 TLR4、NF-κBP65蛋白表達(dá)水平比較(灰度比值

注：與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖3 蛋白表達(dá)水平注：1.空白組；2.模型組；3.陽性藥組；4.低劑量組；5.中劑量組；6.高劑量組

4 討論

翻白草(PotentilladiscolorBunge)又名雞距草、天青地白、雞腿兒、鴨腳參、雞腳草，為薔薇科(Rosaceae)植物翻白草的帶根全草，因葉下發(fā)白被命名為“翻白草”[2]。使用時(shí)采摘全草，除去泥沙雜質(zhì)、洗凈，切成段曬干后在通風(fēng)干燥處收藏備用。李時(shí)珍云：“翻白，以葉之形名；雞腿、天藕，以根之味名也。楚人謂之湖雞腿，淮人謂之天藕。[3]”《本草綱目》《救荒本草》《現(xiàn)代實(shí)用中藥》等古籍均有記載。翻白草味甘、微苦、性平，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有止血止痢、清火解毒、祛風(fēng)除濕、消腫止痛、涼血止血、降低血糖的功效。近年來，廣泛用于治療糖尿病，彝醫(yī)將其用于治療瘧疾、痢疾、瀉痢便血、癰腫瘡毒、風(fēng)濕痛和月經(jīng)不調(diào)等疾病[1]。本實(shí)驗(yàn)據(jù)此研究翻白草對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，并初步探究其作用機(jī)制。潰瘍性結(jié)腸炎屬于炎癥性腸病, 其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確, 可能是多種因素共同作用的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)，促炎因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IFN、TNF等, 抗炎因子如IL-4、IL-10、IL-13等均與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病及病程進(jìn)展有關(guān)[4]。NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子, 參與眾多炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NF-κB最常見的形式是由 p50 和 p65 亞單位組成的異二聚體，p65 亞單位是主要的促炎單位, 其活化在UC發(fā)病中起關(guān)鍵作用, 許多與 UC 相關(guān)的促炎細(xì)胞因子都存在NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)[5-6]。其活化可以控制各種促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄, 因此它對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。炎癥性腸病患者結(jié)腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的NF-κB可被活化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，翻白草給藥組可抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，而HE染色及DAI評分結(jié)果表明，翻白草給藥組可有效緩解UC模型大鼠的腹瀉便血癥狀，改善其活動(dòng)性，并對潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜有一定的修復(fù)作用。由此推測，翻白草是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，調(diào)控炎癥因子網(wǎng)絡(luò)，從而改善大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀，具體細(xì)胞作用通路需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)[7-8]是重要的介導(dǎo)腸黏膜先天防御反應(yīng)的介質(zhì)，在維持腸黏膜和腸道微生態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)13種TLRs(TLR1-13)。TLRs是以模式識(shí)別受體(patterns recognition receptors，PRR)的方式識(shí)別微生物抗原，不同TLRs識(shí)別不同的配體。有研究[9]表明，TLR/MyD88(髓樣分化因子)信號(hào)通路可調(diào)控下游核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控UC細(xì)胞因子水平，從而介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致UC發(fā)生。MyD88信號(hào)傳導(dǎo)途徑是TLR信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路(TLR3除外)，TLR1-9均能通過MyD88途徑完成信號(hào)傳導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)對照組及給藥組TLR4表達(dá)水平均未發(fā)生顯著變化，可能與TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病模型并未產(chǎn)生TLR4相關(guān)識(shí)別配體有關(guān)，而NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑為TLR/MyD88信號(hào)通路的傳導(dǎo)途徑之一。本實(shí)驗(yàn)NF-κB發(fā)生顯著變化，可能是其他TLRs受體參與完成TLR/MyD88-NF-κB信號(hào)通路，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] 楊本雷.中國彝族藥學(xué)[M].昆明：云南民族出版社，2004:313-314.

[2] 張莉，楊杰，陳筱清，等.翻白草的化學(xué)成分[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19(2)：94-96.

[3] 王曉飛.中藥翻白草的本草學(xué)研究[J].四川中醫(yī)，2010，28(3)：43-45.

[4] 梁麗，范恒，段雪云，等.β2AR、β-arrestin2、NF-κB p65在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中的表達(dá)及烏梅丸的干預(yù)作用[J].世界華人消化雜志，2010，18(16)：1650-1655.

[5] 王怡薇，張會(huì)會(huì)，王彥禮，等.黃芩湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κBp65調(diào)控作用研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50(1)：21-27.

[6] 顧培青，沈洪，劉麗，等.清腸化濕方對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸TLR-4、NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2010，19(1)：99-101.

[7] 譚琰，鄒開芳，錢偉，等.潰瘍性結(jié)腸炎患者TLR9表達(dá)變化的研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，43(5)：520-527.

[8] 周全魁，龔杰.美沙拉嗪和柳氮磺吡啶對潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜中TLR4和NF-κb表達(dá)的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015，25(1)：34-36.

[9] 汪悅，查安生.中醫(yī)藥對潰瘍性結(jié)腸炎TLR/MyD88信號(hào)通路NF-κb的干預(yù)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2014，22(8)：426-429.

StudyontheEffectandMechanismofPotentillaDiscoloronUlcerativeColitisinRats

PEI Ling-yan, ZHANG Chun-fang, LIU Wei-zhi△, KE Yu-shi, WANG Lin

(InstituteofChineseMinorityTraditionalMedicine,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objects: To study the pesticide effectiveness of Potentilla discolor Bunge on treating ulcerative colitis(UC) rats, and to explore the molecular mechanism of Potentilla discolor Bunge in the treatment of UC. Methods: The UC rats were induced by trinitrobenzene sulfonic acid-ethanol enema. The rats were divided into six groups: blank control group, model control group, sulfasalazine group, low potentilla discolor, Middle and high dose groups. After 14 consecutive days, chloral hydrate was used to make the rats narcotized and colonic tissue was embedded in paraffin,serially cut and stained for microscopic observation. TLR4 and NF-κBP65 in the remaining colon tissue were detected by western blot. Results: Compared with the blank control group, the DAI index and pathological morphologic change in the model group were significantly different. The therapeutic effect in low-dose group was the best. Compared with the blank control group, the expression of NF-κBP65 was significantly increased in the model group. All the Potentilla discolor Bunge groups could down regulate the NF-κBP65 expression level. Conclusion: Potentilla discolor Bunge could exert its effect on UC by regulating the expression level of NF-κBP65 in UC rats.

PotentilladiscolorBunge; UC; Pharmacological function; TLR4; NF-κBP65

R574.62

B

1006-3250(2017)09-1238-03

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2015MDQN15)-基于腸黏膜屏障損傷修復(fù)的彝藥翻白草抗UC藥效評價(jià)及作用機(jī)制研究

裴玲燕(1989-)，女(朝鮮族)，黑龍江牡丹江人，在讀博士，從事民族醫(yī)藥開發(fā)研究。

劉偉志(1981-)，男(回族)，吉林長春人，高級工程師，醫(yī)學(xué)博士，從事民族醫(yī)藥開發(fā)研究，Tel：010-68939942。

2017-03-17