呂 林，王鳳云，唐旭東，馬祥雪，尹曉嵐，石嘯雙

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院消化科/北京市中醫(yī)脾胃病研究所，北京 100091； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029； 3. 中國中醫(yī)科學(xué)院研究生院，北京 100700)

【實(shí)驗(yàn)研究】

脾虛1號方對脾虛型功能性消化不良大鼠肝臟細(xì)胞色素C氧化酶IV的影響?

呂 林1，王鳳云1，唐旭東2△，馬祥雪2，尹曉嵐3，石嘯雙3

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院消化科/北京市中醫(yī)脾胃病研究所，北京 100091； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029； 3. 中國中醫(yī)科學(xué)院研究生院，北京 100700)

目的：探討脾虛型功能性消化不良(FD)大鼠肝組織細(xì)胞色素C氧化酶IV(COX IV)蛋白與基因表達(dá)及脾虛1號方干預(yù)。方法：70只10 d齡雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(10只)、FD模型組(單模型組10只)、脾虛型FD模型組(50只)。正常組給予2%蔗糖溶液灌胃，F(xiàn)D模型組和脾虛型FD模型組均給予0.1%蔗糖碘乙酰胺蔗糖溶液灌胃，0.2 mL/只·d，連續(xù)6 d。脾虛型FD模型組正常飼料喂養(yǎng)至6周齡后疊加改良小平臺站立，連續(xù)14 d；造模結(jié)束后按隨機(jī)數(shù)字表法分為雙模型組、多潘立酮組、脾虛1號方低、中、高劑量組各10只，藥物干預(yù)14 d，采用免疫組化、Western-blot和RT-PCR方法檢測肝臟組織COX IV蛋白與mRNA表達(dá)量。結(jié)果：與正常組比較，雙模型組大鼠肝臟COX IV mRNA表達(dá)量和平均光密度值顯著降低；與雙模型組比較，脾虛1號方高劑量組大鼠肝臟COX IV mRNA和蛋白表達(dá)量升高。結(jié)論：脾虛型FD大鼠存在COX IV mRNA和蛋白表達(dá)量降低現(xiàn)象，脾虛1號方可能是通過上調(diào)COX IV蛋白與mRNA的表達(dá)提高脾虛證大鼠能量代謝。

脾虛證；功能性消化不良；細(xì)胞色素C氧化酶；中醫(yī)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾為“后天之本，氣血生化之源”。隨著上世紀(jì)80年代劉友章教授“中醫(yī)脾-線粒體相關(guān)”學(xué)說的首次提出[1]，對中醫(yī)脾的生理功能與線粒體的功能特點(diǎn)關(guān)系的研究不斷深入。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物IV又稱為細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)，位于線粒體呼吸電子傳遞鏈的終點(diǎn)，是線粒體氧化能力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)部位，來自線粒體復(fù)合體I、Il和III的電子經(jīng)過細(xì)胞色素c在這里最終傳遞給氧分子，每傳遞1個(gè)電子的同時(shí)，將1個(gè)質(zhì)子從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜間隙，并消耗掉基質(zhì)中的1個(gè)質(zhì)子，在能量產(chǎn)生中起主要作用[2]。為進(jìn)一步深入對中醫(yī)脾虛證的研究，了解COX與功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)的關(guān)系，本研究以脾虛型FD大鼠為模型，以線粒體呼吸鏈的終端酶-COX為研究對象，對功能性胃腸疾病及中醫(yī)脾虛證之間的差異，以及脾虛1號方對COX IV蛋白及基因水平的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD雄性乳鼠70只，7 d齡帶母鼠，每只母鼠帶10只幼鼠，為其提供母乳。母鼠與所帶幼鼠為一籠，飼養(yǎng)于清潔級動物房，12 h節(jié)律，室溫(22±2) ℃，濕度60%～70%。母鼠以全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動物均由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)科技有限公司提供(許可證號SYXK(京)2013-0012，合格證號11401500004829)。

1.2 試劑及儀器

小鼠抗COX IV單克隆抗體(批號ab131177)，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，圣克魯斯生物技術(shù)公司(型號Sc-2005)；渦旋振蕩儀(型號QL-902)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；分光光度計(jì)(型號NANODROP 2000)，賽默飛世爾科技公司；熒光定量PCR儀(型號ABI7500)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；酶標(biāo)儀(型號MULTISKAN MK3)，賽默飛世爾科技公司；電泳儀(型號VE-180)，上海天能科技有限公司；轉(zhuǎn)膜儀(型號VE-186)，上海天能科技有限公司；凝膠成像儀(型號6100)，賽智科技(杭州)有限公司；Image-pro Plus 6 圖形處理軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

碘乙酰胺(批號1001437587)，西奧格瑪公司；蔗糖，拜爾迪公司(批號0552C003)；多潘立酮片，西安楊森制藥有限公司(批號141124263)；脾虛1號方(香砂六君子湯加減)由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科制作。

1.4 造模與分組

參照文獻(xiàn)[3]，健康雄性SPF級SD大鼠乳鼠70只，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分成正常組10只、FD模型組(單模型組10只)和脾虛型FD模型組50只。正常組每日2%蔗糖溶液灌胃，F(xiàn)D模型組和脾虛型FD模型組每日0.1%蔗糖碘乙酰胺溶液灌胃，每只0.2 mL，連續(xù)灌胃6 d。大鼠3周齡時(shí)剔除母鼠分籠，每籠5只，正常鼠飼料喂養(yǎng)。至大鼠6周齡后，正常組繼續(xù)給予正常鼠飼料喂養(yǎng)。脾虛型FD模型組疊加改良小平臺法[4]：向小平臺站立箱(110 cm×60 cm×40 cm)水槽中注水，水溫控制在(22±2) ℃，注水量以水面達(dá)到小平臺臺面下2.0 cm為宜。大鼠在小平臺上可以自由活動但不能休息，以此造成大鼠勞倦。每日17∶00～7∶00進(jìn)行小平臺站立，持續(xù)14 h，連續(xù)14 d。造模結(jié)束后，將脾虛型FD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為雙模型組、多潘立酮組、脾虛1號方低、中、高劑量組各10只。

1.5 給藥

脾虛1號方中劑量組按大鼠用藥劑量=g/60 kg×6.25公式計(jì)算，60 kg成人使用脾虛1號方的原生藥量為125 g，對應(yīng)大鼠生藥用量為1.3 g/100 g，按照1 g顆粒劑含有5.1 g生藥計(jì)算，每只大鼠灌胃給藥量為0.255 g/100 g。按照每只大鼠100 g灌胃1 mL溶液計(jì)算，低、中、高劑量每只大鼠灌胃0.1275、0.2550、0 .5 100 g·100 g-1·d-1，每日1次；按照多潘立酮成人每次1片，每日3次，60 kg成人使用量是30 mg/60 kg，SD大鼠使用量為0.3 125 mg·100 g-1·d-1；正常組、單模型組和雙模型組灌服蒸餾水量為1 mL·100 g-1·d-1，每日上午灌胃給藥1次，連續(xù)用藥14 d。

1.6 取材

在末次給藥禁食不禁水12 h，麻醉前1 h稱重，7%水合氯醛(0.5 mL·100 g-1)麻醉開腹，剪取肝臟組織約2 cm×1.5 cm，4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，放入液氮中，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存待測。另剪取肝臟組織約1.5 cm×1.0 cm，以4 ℃生理鹽水沖洗、濾紙吸干后，置入4%多聚甲醛固定液中，脫水、石蠟包埋、切片備用。

1.7 檢測

1.7.1 免疫組化法測定大鼠肝臟組織中COX IV表達(dá)量 取肝臟組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，PBS(pH7.4)沖洗3 min×3次；滴加50 μL過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加50 μL一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗3 min×3次；滴加50 μL生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加5 μL鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Image-pro Plus 6 圖形處理軟件系統(tǒng)分析，高倍顯微鏡(×200)下觀察結(jié)肝臟組織橫斷面單位面積上COX IV的表達(dá)量，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)然后求取每組大鼠COX IV表達(dá)量的平均值。

1.7.2 Western-blot檢測COX IV蛋白表達(dá) 將肝臟樣本低溫研磨加入RIPA裂解液，碧云天BCA工作液于紫外分光光度儀上測定蛋白濃度。樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。封閉后按照封閉液=1∶10000的比例配置一抗孵育液，4 ℃過夜。洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體振蕩。將PVDF膜于室溫下振蕩溫育。ECL顯色，X線膠片曝光，經(jīng)顯影、定影、掃描后觀察結(jié)果。應(yīng)用Quantity one軟件對掃描圖像的目的條帶進(jìn)行吸光度分析，各目的條帶與GAPDH的吸光度比值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7.3 RT-PCR法檢測COX IV mRNA表達(dá) 從-80℃超低溫冰箱取出肝臟組織，在研磨器中研磨裂解后離心。肝臟組織總RNA提取嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行，所提總RNA經(jīng)核酸測定儀測定樣品RNA含量和純度。根據(jù)總RNA含量逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，COX IV及GAPDH特異性引物由北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：上游引物5’-TGG GCA GCA GTG GCA GAA TGT-3’，下游引物5’-CCC GAA GGC ACA CCG AAG TAGA-3’，擴(kuò)增片段長度84 bp；GAPDH的上游引物5’-TGG AGT CTA CTG GCG TCTT-3’，下游引物5’-TGT CAT ATT TCT CGT GGT TCA-3’，擴(kuò)增片段長度138bp。反應(yīng)條件如下：先94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，總共36個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延長5 min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，采用6100型凝膠成像儀軟件分析。用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct進(jìn)行相對定量，表示該基因的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

圖1表1顯示，各組肝臟組織細(xì)胞胞漿可見棕黃色顆粒。與正常組比較，雙模型組大鼠肝臟COX IV蛋白平均光密度值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與雙模型組比較，脾虛1號方中、高劑量組升高最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠肝組織COX IV蛋白免疫組化觀察(×200)注：A.正常組;B.雙模型組(脾虛型FD模型);C.多潘立酮組;D.脾虛1號方低劑量組;E.脾虛1號方中劑量組;F.脾虛1號方高劑量組;G.單模型組(FD模型)(下同)

組別COXIV平均光密度值(n=4)COXIV灰度值(n=6)COXIVmRNA(n=6)正常組0.02024±0.00291.4440±0.607711.1233±3.0482雙模型組0.01390±0.0009*0.5877±0.04112.9023±0.3862*多潘立酮組0.02230±0.00460.2640±0.0726△4.9782±0.4081△△脾虛1號方低劑量組0.03100±0.00920.7159±0.1379##3.2590±0.5014*#脾虛1號方中劑量組0.03450±0.0084△#0.3231±0.14632.0262±0.4170*##脾虛1號方高劑量組0.05520±0.0172△##1.1873±0.2299△△##6.7938±0.4677△△#單模型組0.01640±0.00490.9696±0.1930##5.1363±0.3686△△

注：與正常組比較：*P<0.05；與雙模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01;與多潘立酮組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.2 Westren-blot檢測COX IV蛋白表達(dá)量

圖2表1顯示，與正常組比較，雙模型組大鼠肝臟COX IV蛋白表達(dá)量降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與雙模型組比較，多潘立酮組降低，而脾虛1號方高劑量組則升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。

圖2 各組大鼠肝臟組織COX IV蛋白電泳注：A.雙模型組;B.脾虛1號方中劑量組;C.脾虛1號方低劑量組;D.單模型組(FD模型);E.脾虛1號方高劑量組;F.多潘立酮組;G.正常組

2.3 RT-PCR檢測COX IV mRNA表達(dá)量

表1顯示，與正常組比較，雙模型組大鼠肝臟COX IV mRNA表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與雙模型組比較，多潘立酮組、脾虛1號方高劑量組、單模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

COX是一種異源寡聚酶，通常含有13個(gè)亞基，定位于線粒體內(nèi)膜，是線粒體呼吸鏈的酶復(fù)合物，它可以從每4個(gè)還原性細(xì)胞色素c中得到1個(gè)電子，傳遞給1個(gè)氧分子，最終把1個(gè)氧分子轉(zhuǎn)變成2個(gè)水分子。在此過程中，COX會結(jié)合4個(gè)質(zhì)子用于產(chǎn)生2個(gè)水分子，同時(shí)把4個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移到膜的另外一側(cè)產(chǎn)生質(zhì)子梯度，即建立跨膜的電化學(xué)勢，隨后ATP合成酶可以利于該電化學(xué)勢合成ATP。在所有哺乳動物真核細(xì)胞中，COX是由細(xì)胞核和線粒體DNA雙編碼合成，其中COX I、COX II和COX III亞基是由線粒體DNA編碼，在進(jìn)化過程中非常保守，并形成一定的催化反應(yīng)中心。COX IV、C0X Va、C0X Vb、COX VIa、COX VIb、COXVIc、COX VIIa、C0X VIIb、COX VIIc和COX VIII亞基由細(xì)胞核基因編碼，指導(dǎo)COX的正確裝配，維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[5]。

FD是一種常見的臨床慢性疾病，其病理機(jī)制主要涉及胃動力障礙占23%，內(nèi)臟高敏感占35%，胃容受性舒張障礙為40%[6]。FD亞型餐后不適綜合征(postprandial distress syndrome,PDS)患者胃電節(jié)律紊亂可能與腹脹、腹部不適、早飽等消化不良癥狀有關(guān)，其機(jī)制可能是胃電節(jié)律紊亂引起胃部肌肉收縮異常、胃排空障礙或胃動力低下[7]。FD患者存在胃動力障礙，可能是由于ATP供應(yīng)不足導(dǎo)致平滑肌收縮減弱，中醫(yī)脾虛則出現(xiàn)疲倦、乏力等癥狀，可能會進(jìn)一步加重FD癥狀。正如《素問·太陰陽明論》所說：“今脾病不能為胃行其津液，四肢不得稟水谷氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉，皆無氣以生，故不用焉?！盋OX是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物，是ATP產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。COX IV在線粒體基因組與核基因組在轉(zhuǎn)錄、翻譯及COX活性等水平上均出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。既往有研究發(fā)現(xiàn)[8]，白種人線粒體DNA單倍型H(7028C)與疾病易感性相關(guān)，其中H型組帶有3010G 的患者常常表現(xiàn)胃排空減慢，而帶有3010A的患者常常伴有慢性腹痛及消化不良。既往主要是針對器質(zhì)性疾病及COX活性進(jìn)行研究[9-10]，本次以功能性胃腸病之FD對象，從COX IV核基因與蛋白表達(dá)角度來進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙模型組大鼠RT-PCR檢測肝臟COX IV mRNA表達(dá)量、Western-blot檢測COX IV蛋白灰度值、免疫組化檢測COX IV蛋白光密度值均較正常組顯著降低，提示脾虛型FD大鼠存在COX IV蛋白和基因降低現(xiàn)象。

本次使用的脾虛1號方是在六君子湯的基礎(chǔ)上加延胡索、枳殼等藥物組成，臨床治療脾虛氣滯證FD有很好的療效[11]。為更好地探討脾虛1號方作用機(jī)制，選擇合適的FD動物模型非常重要[12]。本次使用的脾虛型FD大鼠動物模型具有中醫(yī)脾虛證和FD病理特點(diǎn)[13]。給予藥物干預(yù)后，脾虛1號方高劑量組大鼠RT-PCR檢測肝臟COX IV mRNA表達(dá)量、Western-blot檢測COX IV蛋白灰度值、免疫組化檢測COX IV光密度值均較雙模型組升高，提示脾虛1號方能夠上調(diào)脾虛型FD大鼠肝臟組織COX IV蛋白和mRNA的表達(dá)。本次研究還發(fā)現(xiàn)，脾虛I號方具有一定的量效關(guān)系，高劑量上調(diào)COX IV蛋白和mRNA的表達(dá)更顯著。由于COX是由13個(gè)亞單位構(gòu)成，受到核基因編碼的COX IV占其中一部分，因此對于COX在線粒體呼吸鏈中能量的產(chǎn)生會有一定的影響。中藥健脾方治療脾虛型FD健脾促動力的作用機(jī)制，可能是通過提高COX IV基因及蛋白的表達(dá)來提高COX在線粒體呼吸鏈中的作用。

本研究表明，脾虛型FD模型大鼠存在肝臟組織COX IV mRNA及蛋白表達(dá)降低現(xiàn)象，脾虛1號方能夠上調(diào)COX IV基因及蛋白表達(dá)，進(jìn)而提高能量代謝。既往研究提示，消化系統(tǒng)疾病存在線粒體基因組的異常，如胃腸腫瘤、功能性胃腸疾病等，由于目前整個(gè)COX的調(diào)節(jié)和各個(gè)亞基之間的相互作用還不甚清楚，COX IV能否作為脾虛型FD預(yù)后標(biāo)志或治療靶點(diǎn)，值得深入研究。

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EffectofSpleenDeficiency1PrescriptiononCytochromeCOxidaseIvinLiverofRatswithSpleenDeficiencyTypeFunctionalDyspepsia

LV Lin1, WANG Feng-yun1, TANG Xu-dong1△, MA Xiang-xue2, YIN Xiao-lan3, SHI Xiao-shuang3

(1.DigestivedepartmentofXiYuanHospitalChinaAcademyofChineseMedicalSciences/BeijingInstituteofSpleenandStomachDiseaseofTraditionalChineseMedicineBeijing，Beijing100091,China; 2.GraduateschoolofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029,China; 3.GraduateschoolofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700，China)

Objective: To investigate the expression of COX IV protein and mRNA in Liver tissue of Dyspepsia rats with spleen deficiency type and the intervention by Pixu I Recipe.Method:70 10-day-old male SD rat pups were randomly divided into normal group(n=10), FD model group(single model,n=10),FD with spleen deficiency model group(n=50).The normal control group were gavaged with 0.2 mL of 2% sucrose, meanwhile, the FD with spleen deficiency model group were gavaged with 0.2 mL of 0.1% IA in 2% sucrose,for 6 days.To postnatal 43 day, the FD with spleen deficiency model group was given modified multiple platform method(MMPM), continued 14h every day, for 14 days.The FD with spleen deficiency model group were averagely randomly divided into double model group,domperidone group,low-dose,medium-dose and high-dose Chinese herbs group, and treated by drug for 14d. To detect the COX IV protein expression in liver tissues by immunohistochemistry, Western-blot and RT-PCR. Results: Compared with the normal group, the mRNA and protein expression of COX IV of double model group were significantly decreased; Compared with the double model group, the mRNA and protein expression of COX IV of high-dose Pixu I Recipe group were increased.Conclusion: The FD Rats with Spleen Deficiency had the phenomenon of low expression of COX IV mRNA and protein, and Pixu I Recipe could increase the expression of COX IV protein and mRNA, and then to promote metabolic energy.

Spleen deficiency syndrome; Functional dyspepsia; Cytochrome c oxidase; Traditional Chinese medicine

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB531703)-“脾失健運(yùn)”所致功能性胃腸病“從脾論治”療效及機(jī)制研究；國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81503567)-基于STIM/TRPC/SOCC通路探討脾虛型FD大鼠胃動力障礙及香砂六君子湯干預(yù)機(jī)制；中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015M1227)-基于IP3/Ca2+通路探討香砂六君子湯干預(yù)脾虛型FD大鼠作用機(jī)制；中國博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目(2016T90195)-基于H+/PAR2/TRPV1通路探討香砂六君子干預(yù)FD大鼠機(jī)制

呂 林(1983-)，男，安徽合肥人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事功能性胃腸病的中醫(yī)藥臨床與研究。

唐旭東(1963-)，男，江蘇沭陽人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：txdly@sina.com.cn。

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1006-3250(2017)09-1234-04

2017-03-09