陳 書，蘇冷高娃，張耀丹，白穎慧，魯碧楠，龐宗然

(中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081)

【實驗研究】

菩人丹調(diào)控ob/ob小鼠胰腺組織信號傳導機制探索?

陳 書，蘇冷高娃，張耀丹，白穎慧，魯碧楠，龐宗然△

(中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081)

目的：應用信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片技術(shù)探索菩人丹調(diào)控ob/ob小鼠糖尿病前期病變，減緩T2DM進程的可能信號通路及具體調(diào)變位點。方法：以肥胖、胰島素抵抗為特征的ob/ob小鼠為糖尿病前期模型，利用信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片分析篩選空白組、模型組及菩人丹干預組胰腺組織的磷酸化修飾差異蛋白。結(jié)果： 菩人丹干預組與模型組比較共篩選發(fā)現(xiàn)61個同空白組趨勢一致的磷酸化修飾差異蛋白，PANTHER軟件對其進行生物學功能分類，發(fā)現(xiàn)多參與機體的細胞過程、代謝過程、應激反應、生物調(diào)控、發(fā)育過程及免疫系統(tǒng)過程，DAVID軟件進行Pathway通路富集，導入Cytoscape 3.2.1軟件進行通路間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)互作分析，確認了ob/ob小鼠糖尿病前期的部分磷酸化修飾差異蛋白所涉及的關(guān)鍵通路。結(jié)論：菩人丹干預糖尿病前期病變，延緩T2DM病程發(fā)展，主要與胰島素信號、mTOR信號通路、MAPK信號通路、凋亡、自噬通路及Ca2+通路等密切相關(guān)。

糖尿病前期；菩人丹；磷酸化修飾；信號通路調(diào)控

糖尿病前期(Pre-diabetes)又稱為糖調(diào)節(jié)受損，以胰島素抵抗和肥胖為主要病理表現(xiàn)[1]，是健康人群從正常糖調(diào)節(jié)邁向2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的必經(jīng)之路。我國是糖尿病發(fā)病大國，尤以T2DM為主，除了約1.5億的糖尿病患者，更有約5億的“后備力量”糖尿病前期人群，若任其發(fā)展則迅即“轉(zhuǎn)正”，此時加以干預，改善、逆轉(zhuǎn)糖尿病前期病理狀態(tài)，對T2DM的防控具有重要意義。

中藥復方菩人丹是臨床有效防控糖尿病的效驗方劑，由苦瓜、人參、丹參、葛根、制首烏及制水蛭組成。實驗研究證實，菩人丹在調(diào)節(jié)機體糖脂代謝、增強胰島素敏感性等方面具有顯著的作用和優(yōu)勢[2]，但因其組方成分較為復雜、作用路徑和主要作用靶點尚不明確，亟需深入探究。

因此，本研究擬以自發(fā)性肥胖、胰島素抵抗ob/ob小鼠為糖尿病前期模型，以菩人丹為研究載體干預12周，繼以信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片技術(shù)，分析菩人丹干預糖尿病前期小鼠胰腺組織的磷酸化修飾調(diào)變的通路蛋白及參與調(diào)控的信號通路，結(jié)合生物學功能分析，探索中藥復方菩人丹干預ob/ob小鼠糖尿病前期、減緩T2DM進程的可能信號通路及具體調(diào)變位點。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級C57BL-6J雄性小鼠10只，3周齡，體質(zhì)量(9.70±0.80) g；SPF級雄性ob/ob小鼠20只，3周齡，體質(zhì)量(9.88±2.00) g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供(許可證號SCXK(京)2014-0004)。實驗小鼠均飼養(yǎng)于中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，12 h/12 h光暗周期下，自由攝取食物和水。

1.2 主要藥品及試劑

鮮苦瓜購于北京天地生有機食品有限公司；人參(北京同仁堂，批號 20150524)、制首烏(批號 140701)、丹參(批號 140601)、葛根(批號 140801)均購于北京亞威中藥飲片有限公司；制水蛭(金香中藥飲片有限公司，批號 14051001)；信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片試劑盒(Full Moon BioSystems公司，美國，PEX100)。

1.3 主要儀器

冷凍離心機(Thermo Scientific，美國)；酶標儀(PE Victor, PE，美國)；渦旋振蕩器Vortex5(QILINBER，中國)；搖床TS-2(Kylin-Bell Lab Instruments，中國)；芯片小型離心機ChipMate PMC-082(Tomy，日本)；芯片掃描儀Gene Pix4000B(Axon Instruments，美國)。

2 方法

2.1 菩人丹制備方法

菩人丹組方中，除苦瓜和人參外，其余藥材冷水浸泡2 h，10倍水回流提取2次，每次1.5 h；人參冷水浸泡過夜后，10倍水回流提取2次，每次2 h。過濾后收集提取液，將2次提取液混合于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。鮮苦瓜去籽后由北京開元永盛凍干技術(shù)有限公司代加工為凍干苦瓜，打粉過100目篩，加入之前藥材濃縮液中，蒸餾水補齊，制得菩人丹溶液(相當于生藥量0.90 g·mL-1)。

2.2 分組及給藥

實驗動物于4周齡時分組，C57BL-6J為空白對照組，ob/ob小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組和菩人丹組，每組10只，均飼以普通維持飼料。菩人丹組按照生藥量9.00 g·kg-1灌胃給藥，模型組和空白組給予同體積蒸餾水，各組均灌胃12周，每天1次。實驗結(jié)束后，每組隨機選取3只小鼠進行信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片檢測。

2.3 蛋白樣品處理

2.3.1 樣品蛋白質(zhì)抽提和標記 每只小鼠取綠豆大小新鮮胰腺組織胰尾部分，按照蛋白抽提試劑盒操作步驟進行，樣品經(jīng)芯片專用裂解液裂解后，采用BCA法測定各樣品蛋白濃度，每組3個樣品各取100 μg合成一管。樣本分組編號為C組(空白對照組)、M組(模型組)、P組(菩人丹干預組)。每個樣本各取25 μg蛋白樣品進行標記，存儲于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 芯片封閉、雜交及檢測 將蛋白質(zhì)芯片從冰箱取出，室溫平衡45 min加入封閉溶液，確定芯片表面與條碼向上，室溫封閉45 min洗滌，而后緩慢地將Protein Coupling Mix(Coupling Solution中加入生物素標記的蛋白25 μg)加到芯片表面，室溫在搖床上反應2 h，洗滌3次。將芯片沒入加有Cy3-Streptavidin solution的Detection buffer中， 室溫避光，在搖床上55 r/min反應20 min，洗滌3次，離心干燥芯片表面，掃描芯片。

2.4 芯片數(shù)據(jù)處理

掃描獲取的芯片圖像，使用Gene Pix Pro 6.0軟件讀取原始數(shù)據(jù)并進一步分析。PEX100芯片上含有1318種抗體，覆蓋多個信號通路452個關(guān)鍵蛋白582個磷酸化位點，芯片上大部分抗體為配對抗體(1164個抗體)，即每個磷酸化位點有2個抗體，1個抗體識別該磷酸化位點的磷酸化狀態(tài)，另一個抗體識別該位點的非磷酸化狀態(tài)，具有配對抗體磷酸化位點的磷酸化水平計算是其磷酸化信號值與對應的非磷酸化信號值的比值。

3 結(jié)果

3.1 胰腺組織磷酸化修飾差異蛋白及其位點

圖1表1顯示，將C、P2組分別與M組進行比較，分別求得差異倍數(shù)，以1.5倍為cut off，篩選出2個比較組中磷酸化修飾水平共同顯著上調(diào)的36個蛋白，磷酸化修飾水平共同顯著下調(diào)的25個蛋白，計61個磷酸化修飾差異蛋白。將這61個磷酸化修飾差異蛋白的“Swiss-Prot”號上傳至PANTHER軟件，在數(shù)據(jù)庫軟件中映射到57個功能蛋白。

表1 胰腺組織磷酸化修飾差異蛋白及其位點

磷酸化修飾差異蛋白及其位點蛋白磷酸化修飾水平比值C/MP/MSwiss-ProtHDAC8(Phospho-Ser39)0.440.35Q9BY41c-PLA2(Phospho-Ser505)0.430.53P47712CDK1/CDC2(Phospho-Thr14)0.400.53P24941IR(Phospho-Tyr1361)0.400.33P35568FAK(Phospho-Ser910)0.380.40Q05397PECAM-1(Phospho-Tyr713)0.370.35P16284mTOR(Phospho-Thr2446)0.370.59P42345Caveolin-1(Phospho-Tyr14)0.360.52Q03135HCK(Phospho-Tyr410)0.310.31P08631Calsenilin/KCNIP3(Phospho-Ser63)0.240.57Q9Y2W7

3.2 胰腺組織磷酸化差異修飾蛋白聚類分析

圖2顯示，將61個磷酸化修飾差異蛋白進行聚類分析，橫向代表不同的樣本，縱向代表不同的蛋白，紅色表示磷酸化修飾差異蛋白在分組樣本中表達值高，綠色表示表達值低，圖中的分叉越近說明相似度越高，距離越近。可見，空白對照組與模型組組間差異較大，但各自組內(nèi)聚合度較好；菩人丹組與模型組組間差異也較大，且組內(nèi)聚合度較好。此外，與模型組比較，菩人丹組與空白對照組胰腺組織蛋白的磷酸化修飾作用趨勢較為一致，表明菩人丹有改善ob/ob小鼠糖尿病前期的作用趨勢。

3.3 胰腺組織磷酸化修飾差異蛋白的通路富集及網(wǎng)絡(luò)互作分析

將C、P2組分別與M組進行比較，篩選出61個磷酸化修飾差異蛋白，將這些蛋白的“Swiss-Prot”號在DAVID軟件中進行Pathway通路富集，找出2個比較組中蛋白磷酸化修飾水平共同顯著富集的信號通路，通過KEGG Pathway-Pathway Network構(gòu)建，解析信號起始Pathway和終末Pathway，導入到Cytoscape 3.2.1軟件中進行關(guān)系網(wǎng)展示，并計算不同Pathway在網(wǎng)絡(luò)中的拓撲學距離，網(wǎng)絡(luò)圖中Node的大小與Pathway在網(wǎng)絡(luò)中的拓撲學權(quán)重大小一致，Edge箭頭指向信號下游傳導的Pathway。如圖3確認了ob/ob小鼠糖尿病前期的部分磷酸化修飾差異蛋白所涉及的關(guān)鍵通路，包括胰島素信號通路(Insulin signaling pathway)、 mTOR信號通路(mTOR signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、凋亡通路(Apoptosis)和Ca2+通路(Calcium signaling pathway)等。

圖2 胰腺組織磷酸化修飾差異蛋白的聚類分析

圖3 胰腺組織磷酸化修飾差異蛋白富集的通路網(wǎng)絡(luò)互作分析

4 討論

中醫(yī)對糖尿病前期并沒有明確定義，一般認為“脾癉”與糖尿病前期病變特征最為相似，關(guān)系最為密切?，F(xiàn)存文獻中，“脾癉”一詞最早出現(xiàn)于《素問·奇病論》：“此五氣之溢也，名曰脾癉……此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食肥甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴。[3]”由此揭示了從肥胖到脾癉再到消渴的自然發(fā)展過程，過食肥甘易致肥胖，乃“脾癉”病理基礎(chǔ)，肥甘厚膩積于中焦損傷脾胃，滋生痰濕與邪熱，痰濕阻遏脾氣升清，邪熱燔灼津液，體內(nèi)精微物質(zhì)代謝循行逆亂，形成新的痰濕，新舊痰濕將進一步影響脾氣升清，同時痰濕阻絡(luò)、血行遲滯易致瘀血內(nèi)停，這一過程除演變?yōu)椤跋省蓖?，還可能發(fā)展為微血管、大血管病變相關(guān)的疾病?！捌D”是肥胖轉(zhuǎn)化為各種代謝相關(guān)性疾病的重要過渡階段，因此若能在“脾癉”階段發(fā)現(xiàn)且加以干預控制，可以大大提高患者的生存質(zhì)量。

中醫(yī)藥具有數(shù)千年的臨床應用歷史，其治療糖尿病的優(yōu)勢在于“早期干預”，即糖尿病前期。當機體出現(xiàn)糖調(diào)節(jié)受損時，胰島素抵抗已經(jīng)發(fā)生，中醫(yī)藥不僅可以降脂減肥，有效緩解胰島素抵抗，在防治糖尿病的發(fā)生發(fā)展中更有著西藥無可比擬的優(yōu)勢，避免西藥長期服用導致的肝腎毒性及胃腸道不良反應等。

藥物進入體內(nèi)發(fā)揮藥效的過程，是與受體、酶等蛋白質(zhì)靶點相互作用的過程，蛋白質(zhì)作為機體細胞活性及功能的最終執(zhí)行者，磷酸化修飾是其發(fā)揮生理功能的重要基礎(chǔ)，蛋白酪氨酸殘基磷酸化或絲/蘇氨酸殘基磷酸化后調(diào)節(jié)下游蛋白活性，引起胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)的磷酸化產(chǎn)生級聯(lián)效應，直至激活代謝酶、啟動基因表達及產(chǎn)生細胞骨架變化等生理效應，參與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化等過程。本研究采用信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片(Phospho Explorer Antibody Microarray)，利用其針對每一個特定蛋白磷酸化位點，分別檢測其磷酸化和非磷酸化狀態(tài)，可以同時實現(xiàn)多條信號通路的篩選及具體調(diào)變位點定位的優(yōu)勢，試圖解釋中藥復方菩人丹干預糖尿病前期有效的作用路徑及調(diào)控位點。

肥胖是糖尿病前期的始動因素和病理基礎(chǔ)，肥胖患者體內(nèi)脂肪細胞增大、數(shù)量增多、游離脂肪酸及TNF-α、IL-6等脂肪細胞因子分泌增加，導致組織對胰島素的敏感性下降，發(fā)生胰島素抵抗。研究表明[4-6]，以肥胖、胰島素抵抗為主要病理特征的糖尿病前期，其發(fā)病機理與胰島素信號傳導、mTOR信號傳導、MAPK信號傳導及凋亡、自噬等通路調(diào)控密切相關(guān)。

本實驗中菩人丹干預后，首先IRS-1(Ser794)的磷酸化修飾水平上調(diào)，IR(Tyr1361)的磷酸化修飾水平下調(diào)，原因可能是菩人丹激活了AMPK，上調(diào)了AMPK1(Thr172)及其下游蛋白ACC1(Ser80)的磷酸化水平，從而增加了IRS-1 (Ser794)的磷酸化水平，抑制其酪氨酸位點的磷酸化，參與調(diào)控胰島素信號傳導通路；其次，mTOR(Thr2446)的磷酸化修飾水平下調(diào)，Thr2 446位點的磷酸化可以抑制Ser2448的磷酸化，導致mTOR活性降低，從而負向調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄[4]。菩人丹抑制mTOR(Thr2446)的磷酸化，上調(diào)EPB41 (Tyr418/660)的磷酸化水平，則可以激活mTOR信號傳導通路，從而調(diào)控相關(guān)蛋白的合成及基因轉(zhuǎn)錄，促使β細胞數(shù)量增加和胰島素分泌增強[6]；再次菩人丹上調(diào)c-Raf(Ser296)磷酸化水平，抑制Ras與Raf結(jié)合，下調(diào)MEK1(Thr291)磷酸化水平，促使Raf/MEK/ERK通路與凋亡相關(guān)通路相互作用，從而導致下游BAD(Ser112)磷酸化水平升高，可與14-3-3蛋白形成穩(wěn)定的復合物，不能易位至線粒體外膜，不干擾同家族Bcl-xL與Bcl-2的抑制細胞凋亡活性[7]，抑制胰腺胰島細胞的凋亡；同時p38MAPK、JNK及MSK1磷酸化激活后，可以作用于NFκB通路參與機體的炎癥反應[8]。而T2DM是一個慢性炎癥過程[9]，其發(fā)生發(fā)展與炎癥反應密切相關(guān)。菩人丹干預后使IκB磷酸化降解，導致NFκB活化并轉(zhuǎn)位入核，參與炎癥免疫細胞趨化、浸潤、活化等基因的調(diào)控及信號傳遞過程[10-12]，激活胰島內(nèi)免疫反應，對抗炎癥。研究表明[10]，胰腺β細胞功能障礙與全身炎癥狀態(tài)相關(guān)，炎癥可以激活胰島內(nèi)的免疫反應，使胰島炎癥減輕、β細胞功能得以改善。并且MAPK信號通路的激活還可以作用于Ca2+信號通路，增強β細胞對胰島素的應答，促進β細胞的胞吐作用，從而調(diào)控胰島素的分泌[13]。

此外，近年來研究表明[15-16]，自噬是T2DM及其并發(fā)癥發(fā)生的潛在影響因素，T2DM狀態(tài)下自噬激活增加，以減輕高血糖、高胰島素血癥造成的損傷。研究發(fā)現(xiàn)[17-18],Rab3A- / -糖尿病肥胖小鼠模型的胰島β細胞中自噬激活增加，改變這種自噬激活狀態(tài)，β細胞數(shù)量減少。本實驗中，菩人丹升高AMPK1(Thr172)及其下游蛋白ACC1(Ser80)的磷酸化水平，可以促進自噬作用[14]，提示菩人丹可能也通過影響胰島內(nèi)自噬相關(guān)通路蛋白的磷酸化水平，從而保護及維持糖尿病前期ob/ob小鼠胰島β細胞的數(shù)量、結(jié)構(gòu)與功能，緩解機體胰島素抵抗。

綜上，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，菩人丹可能通過調(diào)控AMPK1(Thr172)、ACC1(Ser80)、IRS-1(Ser794)、IR(Tyr1361)、mTOR(Thr2446)、EPB41(Tyr418/660)、 c-Raf(Ser296)、MEK1(Thr291)、BAD(Ser112)、p38MAPK(Tyr182)、MSK1 (Ser360)、IκB-alpha (Tyr42)、NFκB-p65(Ser276)等蛋白的磷酸化修飾水平，從而調(diào)控胰島素信號傳導通路及其下游mTOR信號通路、MAPK信號通路、凋亡、自噬及Ca2+等通路，干預ob/ob小鼠糖尿病前期，調(diào)節(jié)脂代謝，增強胰島β細胞的分泌作用，保護胰島功能。菩人丹對上述蛋白磷酸化位點修飾的精確調(diào)控以及靶點通路的確定，有待于western blot實驗及通路抑制劑干預實驗進一步驗證。

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ExplorationofPuRenDanRegulationOfOb/ObSignalTransductionMechanismofMousePancreaticTissue

CHEN Shu, SULENG-GAO-WA, ZHANG Yao-dan, Bai Ying-hui, LU Bi-nan, Pang Zong-ran△

(InstituteofChineseMinorityTraditionalMedicine,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objective: Phospho Explorer Antibody Microarray was applied to explore the signal transduction regulation mechanism ofPu-Ren-Danin ob/ob mice pancreas. Method: Setting the obesity and insulin resistant ob/ob mice as model. Pancreas from the blank group, the model group andPu-Ren-Dangroup were detected by Phospho Explorer Antibody Microarray. Result: Compared with model group, 61 different phosphorylated proteins were found inPu-Ren-Dangroup, which the variation trend was consistent with the blank group. Through the biological function analysis, the found 61 proteins were mainly involved in cellular process, response to stimulus, metabolic process, biological regulation, developmental process and immune system process. The Pathway-Act-Network was built according to the interactions with pathways identified in the KEGG database, including insulin signaling pathway, mTOR signaling pathway, MAPK signaling pathway, apoptosis, calcium signaling pathway etc. Conclusion: This may be one of the molecular mechanisms whichPu-Ren-Danintervenes in Pre-diabetes to regress the disease.

Pre-diabetes;Pu-Ren-Dan; reversible phosphorylation; signaling pathway regulation

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1229-05

國家自然科學基金資助項目(81273912)；國家自然科學基金青年基金資助項目(81302946)

陳 書(1989-)，女，遼寧營口人，在讀博士，從事2型糖尿病病機與中醫(yī)藥干預研究。

龐宗然(1966-)，男，河北承德人，研究員，博士研究生導師，從事糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機制與中醫(yī)藥干預研究，E-mail: zrpang@163.com。

2017-03-12