邱 敏，劉 莉，鄒文娟，孫 科

(1. 重慶市中醫(yī)院，重慶 400021； 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)實驗教學(xué)中心，重慶 401331)

【實驗研究】

護(hù)脈散對靜脈炎小鼠血管內(nèi)皮E-selectin、ICAM-1表達(dá)影響的研究?

邱 敏1，劉 莉2Δ，鄒文娟1，孫 科1

(1. 重慶市中醫(yī)院，重慶 400021； 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)實驗教學(xué)中心，重慶 401331)

目的: 觀察護(hù)脈散對長春瑞濱致靜脈炎小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響。方法: 尾靜脈注射長春瑞濱致小鼠靜脈炎模型，采用預(yù)防和治療兩種方式給予低、中、高劑量護(hù)脈散，以多磺酸黏多糖乳膏為陽性對照藥物，比較各組小鼠鼠尾腫脹度變化，觀察各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素(E-selectin)、P-選擇素(P-selectin)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子(VCAM-1)表達(dá)變化。結(jié)果: 不同劑量護(hù)脈散均能減輕靜脈炎小鼠鼠尾炎性腫脹，療效呈劑量依賴性。模型組小鼠E-selectin和ICAM-1表達(dá)明顯高于空白組，護(hù)脈散高劑量預(yù)防組和治療組小鼠E-selectin和ICAM-1的表達(dá)量均較模型組明顯降低，給藥前后各組小鼠P-selectin及VCAM-1均未見陽性表達(dá)。結(jié)論:E-selectin和ICAM-1參與了長春瑞濱致化療性靜脈炎的發(fā)生，“護(hù)脈散”能抑制長春瑞濱導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin和ICAM-1的表達(dá)，從而有效防治靜脈炎。

靜脈炎；長春瑞濱；護(hù)脈散；黏附分子；血管內(nèi)皮細(xì)胞

輸液性靜脈炎是常見的藥源性疾病，有報道其在化療患者中發(fā)生率高達(dá)30%～55%[1-2]，又稱化療性靜脈炎，嚴(yán)重影響腫瘤患者治療的依從性和生活質(zhì)量。長春瑞濱(vinorelbine,VIN)是臨床常用的化療藥物，文獻(xiàn)報道外周靜脈輸注時靜脈炎發(fā)生率高達(dá)30%～45%[3-4]，但其發(fā)生機(jī)制并不完全清楚，公認(rèn)的理論是化療藥物引起血管內(nèi)皮的化學(xué)性損傷，導(dǎo)致無菌性炎癥甚至血栓的形成[5-6]。目前，炎癥反應(yīng)中炎性細(xì)胞的募集過程已被較充分的揭示，即白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面的滾動、黏附、血管內(nèi)爬行、滲出及周圍組織中遷移，不同步驟均伴有不同種類的黏附分子的激活和表達(dá)[7]。然而，黏附分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)與VIN致化療性靜脈炎發(fā)生機(jī)制的關(guān)系并不完全清楚[8]，其關(guān)鍵分子有待揭示。

護(hù)脈散是重慶市名中醫(yī)曾定倫的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用于化療性靜脈炎的防治，累計使用超過1000例，取得了較好的臨床療效。既往研究顯示，該藥物預(yù)防和治療化療性靜脈炎，療效優(yōu)于臨床常用藥物[9-10]。本研究擬通過觀察長春瑞濱對小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響，研究所致化療性靜脈炎的發(fā)生機(jī)制，探討護(hù)脈散防治化療性靜脈炎的療效機(jī)制，并以多磺酸黏多糖乳膏作為陽性對照。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康成年昆明種小鼠120只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量(25±6) g，重慶醫(yī)科大學(xué)實驗教學(xué)中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組各20只，護(hù)脈散高、中、低劑量預(yù)防組、多磺酸黏多糖乳膏預(yù)防組、護(hù)脈散高、中、低劑量治療組和多磺酸黏多糖乳膏治療組各10只。

1.2 藥品和儀器

重酒石酸長春瑞濱注射液(10 mg/ml，江蘇連云港豪森藥業(yè)股份有限公司，批號20150211)；多磺酸黏多糖乳膏(德國路易坡大藥廠，14 g/支，進(jìn)口藥品注冊號H20110296)；0.9%氯化鈉注射液(10ml/支，西南藥業(yè)股份有限公司，批號20150621)；護(hù)脈散(芒硝、生大黃、黃連、黃芩、白芷，上5味藥物按一定比例粉碎過100目篩，按4∶6質(zhì)量比分別稱取藥粉和藥用凡士林，凡士林水浴加熱融化后，加入藥粉，不斷攪拌混勻致冷卻)；E-selectin、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；SP 超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技公司)；電子數(shù)顯卡尺(上海工具廠有限公司)；微量恒速注射泵(美國BSA公司)。

1.3 給藥方法

參照馬麗娟[11]方法制備長春瑞濱致靜脈炎模型，于小鼠尾靜脈近、中1 /3處向近心端穿刺成功后，空白組按5ml/Kg(體質(zhì)量)給予0.9%氯化鈉注射液注射，其余9組均給予10 mg/ml長春瑞濱注射液靜脈注射，給藥量為56.25 mg/kg(體質(zhì)量)，給藥速度0.25 μL/s。(1)注射給藥的同時預(yù)防組小鼠于穿刺點(diǎn)近心端上方均勻涂藥(涂滿鼠尾全周)，護(hù)脈散高、中、低劑量預(yù)防組分別涂藥1.5 g、1.0 g、0.5 g，多磺酸黏多糖乳膏預(yù)防組每只涂藥1.0 g，間隔4 h后再次涂擦藥物1次；(2)注射給藥24 h后各治療組小鼠據(jù)上述方法給藥，每次間隔6 h，共計給藥3次，模型組小鼠不做任何處理。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 鼠尾腫脹度檢測 給藥前、給藥6 h、給藥24 h、給藥48 h后，均于穿刺點(diǎn)近心端上方3 cm處用電子數(shù)顯卡尺測量鼠尾直徑，計算腫脹程度。腫脹度=[(注射后鼠尾直徑- 注射前鼠尾直徑)/注射前鼠尾直徑] ×100%。

1.4.2 SP法免疫組化染色 (1)靜脈給藥6 h后，脫頸處死空白組、模型組各10只及護(hù)脈散高劑量預(yù)防組全組小鼠；(2)靜脈給藥后48 h后處死空白組、模型組剩下的10只及護(hù)脈散高劑量治療組全組小鼠。取各組小鼠尾部從靜脈穿刺點(diǎn)至以上5 cm尾部組織，迅速置于10%福爾馬林溶液中固定4 h以上，以20%EDTA進(jìn)行脫鈣處理后1wk，再制作成石蠟切片；(3)免疫組化染色后，胞質(zhì)中黃褐色為陽性細(xì)胞。在高倍視野下(×400)采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定陽性區(qū)域面積，計算其陽性表達(dá)積分吸光度，以平均光密度(mean optical density，MOD)反應(yīng)蛋白的表達(dá)水平高低。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組鼠尾腫脹度比較

表1顯示，與空白組比較各組小鼠給藥后6、24、48 h鼠尾腫脹度明顯增加(P<0.05或P<0.01)，證明造模方法成功；給藥6 h后，護(hù)脈散高劑量預(yù)防組小鼠鼠尾腫脹度較模型組明顯減小(P<0.05)，而護(hù)脈散中、低劑量預(yù)防組及多磺酸黏多糖乳膏預(yù)防組小鼠鼠尾腫脹度雖較模型組小，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；給藥48 h后，護(hù)脈散高、中、低劑量治療組和多磺酸黏多糖乳膏治療組小鼠鼠尾腫脹度與模型組比較明顯減輕(P<0.05或P<0.01)，而護(hù)脈散高、中劑量治療組與多磺酸黏多糖乳膏治療組比較，鼠尾腫脹度減輕更加明顯(P<0.05)。

2.2 各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞E、P-selection表達(dá)比較

表2圖1顯示，模型組和護(hù)脈散預(yù)防組小鼠尾靜脈給予VIN6h后，與空白組比較血管內(nèi)皮細(xì)胞表面迅速表達(dá)E-selection(P<0.01)；護(hù)脈散預(yù)防組與模型組比較， 血管內(nèi)皮細(xì)胞E-selection量表達(dá)明顯降低；給藥48 h后，模型組尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞E-selection表達(dá)量較本組給藥6 h后明顯降低(P<0.05)，而護(hù)脈散治療組與模型組比較降低明顯；圖2顯示，各組小鼠給藥后6 h及48 h，P-selection在尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)量很小，其光密度值與空白組給藥后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1表達(dá)比較

表3圖3顯示，模型組小鼠給予VIN6h后，與空白組比較尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞已有ICAM-1表達(dá)(P<0.05)；護(hù)脈散高劑量預(yù)防組給藥6 h后尾靜脈血管內(nèi)皮亦可見ICAM-1表達(dá)陽性細(xì)胞，但與模型組比較表達(dá)量明顯減少(P<0.05)；給藥48 h后，模型組尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)量較本組給藥6 h后及空白組明顯升高(P<0.01)；護(hù)脈散高劑量治療組與模型組比較，尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；圖4顯示，各組小鼠給藥后6 h及48 h，尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組鼠尾腫脹度比較

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01；與多磺酸黏多糖乳膏治療組比較：△P<0.05

表2 各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞E、p-selection表達(dá)比較

注：與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與本組給藥6 h后比較:△P<0.05

圖1 各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞E-selection的表達(dá)(×400)

圖2 各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞P-selection表達(dá)(×400)

組別ICAM-1VCAM-1給藥6h后給藥48h后給藥6h后給藥48h后空白組0.093±0.0230.124±0.0320.172±0.1210.217±0.116模型組0.279±0.071*0.728±0.254**△△0.213±0.1140.209±0.144護(hù)脈散高劑量預(yù)防組0.117±0.018#0.198±0.151護(hù)脈散高劑量治療組0.321±0.136**##0.242±0.134

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01；與本組給藥6 h后比較:△△P<0.01

圖3 各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)(×400)

圖4 各組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 VCAM-1表達(dá)(×400)

3 討論

化療性靜脈炎發(fā)生的分子基礎(chǔ)是炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮之間黏附分子的相互作用[12]。Butcher和Springer提出了白細(xì)胞黏附級聯(lián)的多步驟模式：E-/P-selectin在血管內(nèi)皮表達(dá)介導(dǎo)白細(xì)胞沿血管壁滾動的最初黏附，隨后ICAM-1、VCAM-1介導(dǎo)緊密黏附和內(nèi)皮下遷移、滲出過程[13-14]。多項研究表明，VIN能增加血管內(nèi)皮ICAM-1的表達(dá)，研究者推測這可能是其導(dǎo)致靜脈炎發(fā)生的原因[15-17]。既往研究顯示，護(hù)脈散既能有效緩解化療性靜脈炎患者臨床癥狀[9]，又能有效預(yù)防化療性靜脈炎[10]，顯示其療效機(jī)制可能涉及ICAM-1及黏附級聯(lián)的其他分子。本研究擬通過預(yù)防和治療用藥兩種方式，分析黏附分子在VIN致化療性靜脈炎中的作用及護(hù)脈散的療效機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，護(hù)脈散能顯著減輕靜脈炎小鼠尾部炎性腫脹度且呈明顯的量效關(guān)系，護(hù)脈散高、中劑量治療組療效優(yōu)于多磺酸黏多糖乳膏治療組。模型組給藥6 h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面可見E-selectin大量表達(dá)，而P-selectin蛋白在給藥前后各組小鼠均未見陽性表達(dá)，表明VIN致化療性靜脈炎的機(jī)制與其增加E-selectin表達(dá)有關(guān)，而似乎P-selectin未參與其致靜脈炎的發(fā)生過程。護(hù)脈散預(yù)防組和治療組小鼠尾靜脈E-selectin表達(dá)量均較模型組明顯降低，表明護(hù)脈散能明顯抑制VIN導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞初始黏附，從而減輕后續(xù)的炎癥反應(yīng)，提示這是“護(hù)脈散”能有效預(yù)防VIN致化療性靜脈炎的原因之一。本研究表明，VIN能顯著增加模型組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)。本效應(yīng)從給藥后6 h起至給藥后48 h持續(xù)加強(qiáng)，與既往研究一致[10-12]。護(hù)脈散治療組ICAM-1表達(dá)量較模型組明顯降低，揭示了“護(hù)脈散”能有效治療化療性靜脈炎的療效機(jī)制。而VCAM-1在給藥前后各組小鼠中均未見陽性表達(dá)，表明VCAM-1蛋白并未參與VIN致化療性靜脈炎的過程。

根據(jù)化療性靜脈炎“紅、腫、熱、痛”的臨床表現(xiàn)，本病屬于中醫(yī)“脈痹”范疇?！端貑?四時刺逆從論》曰:“陽明有余病脈痹身時熱”，提出“脈痹”病名及癥狀。林佩琴在《類癥治裁》中云：“脈痹者，風(fēng)濕郁熱，經(jīng)隧為壅”，而“熱”“壅”分別道出靜脈炎炎性反應(yīng)和血栓形成的兩大病理變化,彼則為風(fēng)寒濕邪外侵，脈道氣機(jī)不暢化而為熱，化療性靜脈炎則為穿刺及藥物內(nèi)傷脈絡(luò)，毒蘊(yùn)為熱。曾定倫據(jù)此提出“熱壅血瘀”為化療性靜脈炎的中醫(yī)病機(jī)，即靜脈穿刺及藥物毒性等原因?qū)е旅}絡(luò)創(chuàng)傷，加之化療細(xì)胞毒性藥物損傷脈絡(luò)，濕熱毒邪外侵壅滯脈道，脈絡(luò)阻塞不通，氣血瘀滯，瘀血阻滯，血行不暢，不通則痛；氣血運(yùn)行不暢，血停為水，溢于脈外，津液輸布受阻則腫脹；瘀血內(nèi)蘊(yùn)，蘊(yùn)久化熱則局部發(fā)熱、發(fā)紅。曾定倫以“清熱解毒、消腫軟堅、活血化瘀”立法，以古方 “保生救苦散”為基礎(chǔ)制方。本方載于《蘭室秘藏·瘡瘍門》，由生寒水石、大黃、黃連、黃柏組成，治療“火燒或熱油烙及脈痹脫肌肉者”，采用“上為細(xì)末，用油調(diào)涂之，或干用此藥涂之，其痛立止，日近完復(fù)，永無破傷風(fēng)之患”，提出針對病灶局部外用的方法，縮短起效時間，并大大減少并發(fā)癥，改善局部病灶的預(yù)后。曾定倫易寒水石為芒硝，取黃芩代黃柏，加白芷創(chuàng)制“護(hù)脈散”局部外敷治療本病。方中生大黃外用能涼血消腫、逐瘀通經(jīng)，《本經(jīng)》稱其“主下瘀血，血閉，破癥瘕積聚……推陳致新”。輔之以黃連、黃芩清熱解毒、涼血瀉火、消腫止痛；芒硝外用取其清熱消腫之功，更重要的是芒硝有軟堅散結(jié)之效，對于靜脈炎發(fā)生過程中組織充血、腫脹及脈管壁條索狀改變療效顯著。曾定倫將寒水石改為芒硝，并在該方中重用，加辛散通絡(luò)止痛之白芷，迅速緩解靜脈炎“腫、痛”癥狀，體現(xiàn)出老中醫(yī)獨(dú)特的臨床思辨能力。

本研究結(jié)果表明，E-selectin和ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的陽性表達(dá)參與了長春瑞濱致化療性靜脈炎的發(fā)生，護(hù)脈散能明顯降低上述2種黏附分子的表達(dá)，減輕炎性細(xì)胞對血管內(nèi)皮的黏附、遷移、滲出，從而有效防治長春瑞濱致化療性靜脈炎。

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EffectofHuMaiPowderontheExpressionofE-selectinandICAM-1inVascularEndothelialCellsofMicewithPhlebitis

QIU Min1, Liu Li2Δ, ZOU Wen-juan1, SUN Ke1

(1.ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021，China; 2.ExperimentalTeachingCenterofChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331，China)

Objective:to study the effects of HuMai powder on expression of E-selectin and ICAM-1 in mouse vascular endothelial cells with infusion phlebitis.Methods:The phlebitis model of mice was established by injection of vinorelbine via tail vein．Different dose HuMai powder were used as two methods of prevention and treatment, compared by mucopolysaccharide polysulfate cream as a control drug, the degree of tail swelling was as effectiveness index in different mice groups. E-selectin, P-selectin, ICAM-1, VCAM-1 were also as observation index in mouse vascular endothelial cells. Results Different dose HuMai powder can effectively alleviate the inflammatory swelling of the tail of mice induced by vinorelbine, the effect was dose dependent. As compared with the blank group, Vinorelbine can increase the expression of E-selectin and ICAM-1 in mouse vascular endothelial cells in the model group. No positive expression of P-selectin and VCAM-1 were found in mouse vascular endothelial cells before and after drug administration. The expression levels of E-selectin and ICAM-1 in mouse vascular endothelial cells were significantly lower in high dose prevention group and treatment group than that of model group. Conclusion:The positive expression of E-selectin and ICAM-1 in vascular endothelial cells were involved in the occurrence of chemotherapy infusion phlebitis induced by Vinorelbine. HuMai powder could inhibit the expression of E-selectin and ICAM-1 in vascular endothelial cells caused by vinorelbine, thus effectively prevent and cure infusion phlebitis.

Infusion phlebitis; Vinorelbine; HuMai powder; Adhesion molecule; Vascular endothelial cells

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1224-05

重慶市衛(wèi)計委中醫(yī)藥科技項目(ZY201402041)；國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項目[國中醫(yī)藥人教發(fā)〔2013〕47號]

邱 敏(1975-)，男，重慶市江津區(qū)人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合惡性腫瘤的臨床與研究。

劉 莉(1974-),女，重慶市銅梁縣人，講師，醫(yī)學(xué)本科， Tel:18623106116，E-mail:1140641979@qq.com。

2017-02-20