周紅艷，李開言，黃 霞，孫 為，張 薇，王守富，李秋鳳，陳陽春

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，鄭州 450004)

【實驗研究】

野薔薇根醇提物對大鼠動脈粥樣硬化的影響?

周紅艷，李開言△，黃 霞，孫 為，張 薇，王守富，李秋鳳，陳陽春

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，鄭州 450004)

目的：觀察YT對大鼠AS的影響。方法：50只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、YT低、高劑量組、AL組，灌胃給藥90 d，每2周稱攝食量和體質(zhì)量，調(diào)整灌胃量；空白組喂標準飼料，其余組高脂飲食聯(lián)合注射維生素D3并加免疫損傷造成AS；末次給藥1h后，取主動脈進行病理組織學(xué)觀察，比色法檢測血清中SOD、MDA水平，化學(xué)發(fā)光法檢測血清中CRP水平，ELISA法檢測血清中sCD40L、ADNP、IL-18、IL-16水平，放射免疫分析法檢測血清中IL-6、TNF-α水平。結(jié)果：YT低、高劑量組明顯改善AS大鼠主動脈壁增厚、脂質(zhì)沉積，減少泡沫細胞形成及淋巴細胞浸潤；YT低劑量組體質(zhì)量增加幅度、MDA水平顯著降低，攝食量顯著增加，YT高劑量組IL-18水平顯著降低。結(jié)論：YT可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)改善AS。

野薔薇根醇提物；動脈粥樣硬化；脂質(zhì)過氧化；炎癥反應(yīng)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種慢性血管炎癥疾病，其血管內(nèi)膜或功能受損導(dǎo)致通透性改變，血脂異常沉積到血管壁形成AS斑塊。該病最早于兒童時期發(fā)生，潛伏期漫長，但后期往往急性加劇且危害極大，常見并發(fā)癥如急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛、腦卒中等。研究發(fā)現(xiàn)，野薔薇中含有大量具有降血糖、降血脂等生理功能的總皂苷、黃酮等[1-2]，醇沉淀物中含有增強機體免疫功能、降血脂等作用的多糖等[3-4]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，野薔薇根具有降低總膽固醇、甘油三酯和?-脂蛋白作用[5]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，野薔薇根醇提物(簡稱YT)可減低高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的血清和主動脈組織中膽固醇水平，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、血鈣水平和內(nèi)皮功能紊亂來改善AS[6]。本研究應(yīng)用高脂飲食聯(lián)合注射維生素D3(vitamin D3, VitD3)[7]并加免疫損傷的方法復(fù)制大鼠AS模型，通過主動脈病理組織學(xué)觀察YT改善AS的程度以及血清氧化應(yīng)激、炎癥相關(guān)指標水平的改變，進一步探討YT改善AS的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

YT，河南省中醫(yī)藥研究院中藥所(原生藥含量3.33 g/mL，批號20130322)；阿托伐他汀鈣片(簡稱阿樂, AL)，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格 10 mg/片，批號131107)；維生素D3注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格1 mL, 7.5 mg，30萬U)，國藥準字H31021404，產(chǎn)品批號121004);卵清白蛋白(Albumin Egg, AE),美國Sigma(規(guī)格100 g/瓶，產(chǎn)品批號326A053);完全弗氏佐劑(Freund’s Complete Adjuvant, FCA)(規(guī)格10 ml/瓶，產(chǎn)品批號107K8618)；白細胞介素18(Interleukin-18, IL-18)、白細胞介素16(Interleukin-16, IL-16)、脂聯(lián)素(Adiponectin, ADNP)、可溶性CD40配體(Soluble CD40 Ligand, sCD40 L)、Elisa酶聯(lián)免疫試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司(批號20130624)；白細胞介素6(Interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF-α)、放射免疫試劑盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司(批號20130625)。

1.2 動物及飼料

雄性SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量(80±20) g，購自河南省實驗動物中心(許可證號SCXK(豫)2010-0002, No.41003100000747)。高脂飼料配方：2% 膽固醇，10% 豬油，5% 白糖，0.3% 膽酸鈉，5% 蛋黃粉，0.2% 丙基硫氧嘧啶，77.5% 標準飼料。

1.3 大鼠AS模型的制備

大鼠50只，按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型對照組(蒸餾水10 mL/kg)、YT低劑量組(4.15 g/kg)、YT高劑量組(8.30 g/kg)和AL組(2.0 mg/kg)，灌胃給藥90 d。每2周稱大鼠攝食量和體質(zhì)量，調(diào)整灌胃量；參照文獻[6-8]改良對SD大鼠進行AS造模。除空白組外，其余各組給予高脂喂養(yǎng)，并于第15、45、75天腹腔注射(ip)60萬U/kg、10萬U/kg、10萬U/kg的VitD3。第16天取1 mL含3 mg/kg AE的抗原乳劑對大鼠背部皮下多點注射進行免疫損傷。第46、61、76天對大鼠均ip 1 mL AE溶液(2.5 mg/kg)激發(fā)免疫反應(yīng)，從而復(fù)制大鼠AS模型。

1.4 指標檢測

末次給藥1 h后，大鼠均以10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉，腹主動脈取血分離血清。迅速解剖大鼠，摘取主動脈組織，常規(guī)固定、脫水、切片、HE染色，進行病理組織學(xué)觀察。比色法檢測血清超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平，發(fā)光法檢測C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)，ELISA法檢測血清IL-18、IL-16、sCD40 L、ADNP，放免法檢測血清IL-6、TNF-α。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS.16.0軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YT對AS大鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

表1、2顯示，在實驗的90 d期間，空白組大鼠體質(zhì)量隨實驗時間延長逐步增加。模型各組大鼠體質(zhì)量也有增加，但增加幅度明顯低于空白組，并差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，YT低劑量組與AL組體質(zhì)量增加幅度明顯降低(P<0.05)；各組大鼠攝食量結(jié)果比較表明，模型各組大鼠比空白組大鼠攝食量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠實驗90 d體質(zhì)量經(jīng)時變化比較

注：與空白對照組比較：※P<0.05；與模型對照組比較：△P<0.05

表2 各組大鼠實驗90 d攝食量比較

注：與空白對照組比較:※P<0.05；與模型對照組比較：△P<0.05

2.2 YT對AS大鼠血清SOD、MDA的影響

表3顯示，與空白組比較模型組大鼠血清SOD檢測值下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，MDA值升高具有顯著意義(P<0.05)；YT低劑量組、AL組均降低模型組MDA水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 YT對AS大鼠血清炎性因子的影響

表4顯示，模型組血清TNF-α、IL-6 均顯著高于空白組(P<0.05)，各藥物干預(yù)組雖有降低血清TNF-α、IL-6水平的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組CPR含量顯著高于空白組(P<0.05)，而各藥物干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ELISA法檢測各組血清IL-16、IL-18、sCD40 L水平，結(jié)果顯示模型組檢測值均高于空白組，其中IL-18、sCD40 L比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組IL-18均值降低，與YT高劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各給藥組sCD40 L均值也降低，AL組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組大鼠血清ADPN水平顯著低于空白組(P<0.05)。與模型組比較，YT干預(yù)組具有升高血清ADPN趨勢，AL組可顯著提高血清ADPN水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 大鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖1 各組大鼠主動脈病理變化比較

圖1顯示，空白對照組主動脈壁的內(nèi)膜、中膜、外膜三層結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮完整，中膜彈力纖維呈環(huán)形排列，內(nèi)皮下、肌層及外膜均未見病變。模型組主動脈壁的三層結(jié)構(gòu)尚可，但內(nèi)膜明顯增厚、局部隆起或伴損傷，內(nèi)皮下有粥樣物質(zhì)沉積，結(jié)構(gòu)稍紊亂，可見泡沫細胞和結(jié)晶體形成，并有淋巴細胞或巨噬細胞浸潤。病變區(qū)的肌層受壓萎縮、變薄，彈力纖維結(jié)構(gòu)不清，外膜無明顯異常。YT低劑量組內(nèi)膜偶見細胞間物質(zhì)沉積，其他無異常。YT高劑量組內(nèi)膜增厚，出現(xiàn)局灶性損傷，肌層完好，其他正常。AL組主動脈基本光滑平坦，未見明顯病變。

表3 各組大鼠血清SOD、MDA比較

注：與空白對照組比較：※P<0.05；與模型對照組比較：△P<0.05

3 討論

野薔薇(Rosa multiflora Thunb)別稱白殘花、多花薔薇、刺花，果實名營實，花名刺莉花，花、果、根、莖都供藥用。野薔薇根苦、澀、寒、無毒，歸脾、胃、腎經(jīng)，最早收載于《名醫(yī)別錄》，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)、固精縮尿之功效。梁坤等[8]發(fā)現(xiàn)，刺玫薔薇莖醇提物具有抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病、抗菌消炎等多種生理功能。焦淑萍等[9]發(fā)現(xiàn)，野薔薇果可顯著降低高脂大鼠血清TC、TG內(nèi)皮素(ET)含量(P<0.01)，并明顯提高HDL-C、NO含量(P<0.01)。王玲等[10]研究報道，野薔薇各部位醇提物中總黃酮含量豐富，尤其根皮中含量最高，故研究野薔薇根醇提物對動脈粥樣硬化的影響對擴大藥源具有重要意義。

表4 各組大鼠血清炎性因子水平比較

注：與空白對照組比較:※P<0.05；與模型對照組比較：△P<0.05

氧化應(yīng)激存在于AS整個發(fā)展過程中[11]。脂質(zhì)過氧化能夠直接損傷血管內(nèi)皮細胞或氧化修飾低密度脂蛋白，形成氧化型低密度脂蛋白，進入血管壁內(nèi)皮下間隙，被單核細胞、巨噬細胞識別和吞噬，致使內(nèi)皮細胞蛻變，形成泡沫細胞，成為AS病變的基礎(chǔ)或加重AS斑塊的形成[12]。SOD是體內(nèi)清除氧自由基的主要抗氧化酶之一，MDA 是脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物之一，其含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，是脂質(zhì)過氧化也是細胞氧化損傷的一個重要檢測指標。表3顯示，野薔薇根醇提物不能提高 SOD活力，但可以顯著降低MDA含量，提示該藥可能通過減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生發(fā)揮抗氧化的作用。

美國學(xué)者Ross提出“AS是一種炎癥性疾病”[13]，促炎與抗炎因子平衡失調(diào)成為AS研究的熱點。AS炎癥反應(yīng)與痰、瘀、毒的聯(lián)系日益受到重視，胡世云等[14]提出AS炎癥反應(yīng)與中醫(yī)學(xué)感受外來邪毒和內(nèi)生邪毒理論正好吻合。痰瘀阻絡(luò)是AS的基本病理變化，虛、瘀、毒相互交結(jié)，共同影響著AS的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，多種細胞(如單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等)分泌大量炎性因子，如 CRP[15]、TNF-α、IL-6[16]、IL-18[17-19]、sCD40L[20-22]等。炎性因子主要通過損傷內(nèi)皮、誘導(dǎo)單核細胞與內(nèi)皮黏附及向內(nèi)膜下遷移等環(huán)節(jié)促進AS形成，并可通過促進細胞外基質(zhì)降解和抑制其修復(fù)，增加斑塊的不穩(wěn)定性[23]。ADPN可抑制巨噬細胞對膽固醇酯的攝取，減少單核巨噬細胞分泌TNF-α，抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[23]，直接影響AS的發(fā)生發(fā)展。表4、5顯示，YT可顯著減低AS大鼠血清炎性因子IL-18水平，與模型對照組比較具有顯著意義，也可不同程度地降低AS大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP、sCD40 L含量，升高抗炎因子ADPN含量，表明YT可通過調(diào)節(jié)促炎與抗炎因子平衡影響AS。

綜上，YT對于大鼠AS 的發(fā)生發(fā)展具有一定的干預(yù)作用，其作用環(huán)節(jié)可能與減少氧化損傷、調(diào)節(jié)促炎與抗炎因子平衡有關(guān)。

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EffectsofEthanolExtractofRosaRosaonAtherosclerosisinRats

ZHOU Hong-yan, LI Kai-yan△, Huang Xia, Sun Wei, Zhang Wei, Wang Shou-fu, Li Qiu-feng, Chen Yang-chun

(HenanProvinceChinesemedicineresearchinstitute,InstituteofChineseMedicine,Zhengzhou450004,China)

Objective:To observe the influence of alcohol extraction of Rosa multiflora Thunb on atherosclerosis rats. Methods:Fifty uniform weight SD rats were randomly divided into 5 groups, including blank control group, model group, Rosa multiflora Thunb extract low and high group, atorvastatin calcium tablet group; Intragastric administration for 90 days and gastric volume was adjusted with food ration and weight every two weeks; Rats in blank control group were fed with standard diet, rats in other groups were fed with high-fat diet, intraperitoneally injected vitamin D3 and dealed with immune injury. One hour after the last delivery, take the rat aorta to observe the pathological tissue. The level of superoxide dismutase and malondialdehyde was detected by colorimetric method. The level of C-reactive was detected by chemiluminescence. The level of soluble CD40L, Adiponectin, Interleukin-18, Interleukin-16 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The level of Interleukin-6 and Tumor necrosis factor-α was detected by radioimmunoassay. Results:The incrassate aortic wall and lipidosis could be improved obviously by alcohol extraction of Rosa multiflora Thunb of low and high dose group, also foam cell formation in artery endothelium and lymphocytes infiltration could be decreased. The rats in YT low dose group showed remarkablely decreased weight gain and malondialdehyde, meanwhile increased food ration. The rats in YT high dose group showed remarkablely decreased interleukin-18. Conclusions:Rosa multiflora Thun extract could improve AS through regulating lipid peroxidation and inflammatory reaction.

Rosa multiflora Thunb extract; atherosclerosis; lipid peroxidation; inflammatory reaction

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1220-04

河南省公益預(yù)研項目(1603582)-野薔薇根總黃酮的提取、純化及抗動脈粥樣硬化藥理活性研究；國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目[國中醫(yī)藥人教發(fā)(2012)149號]

周紅艷(1973-)，女，江蘇銅山人，高級實驗師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)和中藥藥理學(xué)研究。

李開言(1986-)，女，河南駐馬店人，研究實習(xí)員，醫(yī)學(xué)碩士，從事中藥藥理和分子生物學(xué)研究，Tel:13849187713,E-mail：likaiyan_0917_2006@126.com。

2017-04-09