李啟沅，何旭珩，王 縣，劉小盼，孫建波，廖秋燕，尹潔芳，賈 佳，唐中湘，李 雪

·生物標(biāo)志物·

前處理方法及凍融次數(shù)對(duì)尿液蛋白標(biāo)志物質(zhì)量影響的探究

李啟沅，何旭珩，王 縣，劉小盼，孫建波，廖秋燕，尹潔芳，賈 佳，唐中湘，李 雪

目的探究不同前處理方法及凍融次數(shù)對(duì)尿液樣本蛋白質(zhì)量的影響。方法 取樣后的尿液樣本經(jīng)過(guò)離心與不離心處理后，分別于室溫及4℃冷藏放置4、12、24、48、72 h，及在－80℃反復(fù)凍融1、3、5、10次后，經(jīng)過(guò)橋式酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)叢生蛋白、腎損傷分子-1、胱抑素C及視黃醇結(jié)合蛋白4種蛋白的質(zhì)量濃度變化。結(jié)果 經(jīng)離心處理的樣本，在室溫或4℃冷藏放置48 h后，叢生蛋白質(zhì)量濃度顯著降低。未經(jīng)離心處理的樣本，室溫放置24 h后，叢生蛋白質(zhì)量濃度顯著降低；4℃冷藏條件下蛋白相對(duì)穩(wěn)定，在放置72 h后顯著降低。4種蛋白－80℃反復(fù)凍融1、3、5、10次后，質(zhì)量濃度均無(wú)顯著變化；未經(jīng)離心處理樣本，蛋白質(zhì)量濃度較離心處理樣本高。結(jié)論 在冷凍保存前，盡量將尿液樣本先放置在4℃環(huán)境下處理或暫存，且暫存時(shí)間不超過(guò)72 h；若室溫放置，時(shí)間不超過(guò)24 h；且根據(jù)研究用途決定是否離心。樣本反復(fù)凍融10次對(duì)尿液蛋白質(zhì)量無(wú)明顯影響，可以根據(jù)檢測(cè)需求及實(shí)際條件，確定樣本是否分裝及分裝管數(shù)等。

尿液蛋白標(biāo)志物；尿液儲(chǔ)存；標(biāo)志物質(zhì)量

尿液是有重要意義的排泄物，其主要成分為尿素、無(wú)機(jī)鹽、微量蛋白質(zhì)、代謝物等，其成分的變化反映代謝異常、泌尿系統(tǒng)或其他組織器官的病變，可作為無(wú)創(chuàng)、有效的疾病診斷生物材料。其中，尿液中某些蛋白的變化是包括腎損傷等疾病的重要標(biāo)志，為疾病的診斷提供參考[1-5]。尿液也是生物樣本庫(kù)存儲(chǔ)重要的樣本之一，其采集、處理與保存的規(guī)范化操作是質(zhì)量控制的重要保證；要獲得可靠的科學(xué)研究及應(yīng)用成果，必須保證尿液樣本完整性[6-7]。

叢生蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為80×103，它與清除細(xì)胞的碎片和凋亡的細(xì)胞相關(guān)。研究表明，叢生蛋白可作為膀胱癌診斷標(biāo)志物[8]。腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)是一種跨膜蛋白，可作為早期腎損傷的診斷標(biāo)志物[9-10]。胱抑素C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，廣泛存在于各種組織的有核細(xì)胞和體液中，由122個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為13.3×103，是一種低相對(duì)分子質(zhì)量、堿性非糖化蛋白質(zhì)，也是新近發(fā)展起來(lái)的評(píng)估腎功能的一種敏感性好、特異性高的指標(biāo)[11-12]。視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP)是血液中維生素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由肝臟合成，廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。測(cè)定RBP能早期發(fā)現(xiàn)腎小管功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，還可作為腎功能早期損害和監(jiān)護(hù)治療的指標(biāo)[13-14]。

作者選用這4種常用作疾病診斷，且在健康人尿液中普遍存在的蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，采用橋式酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)方法，探討離心或者不離心情況下，前處理溫度、前處理放置時(shí)間及反復(fù)凍融對(duì)尿液樣本蛋白質(zhì)量的影響，為優(yōu)化樣本采集、規(guī)范尿液樣本前處理操作流程、保存條件及提高樣本保存質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 收集來(lái)自健康成年人的晨尿樣本，男女各2人，項(xiàng)目經(jīng)國(guó)家基因庫(kù)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，捐贈(zèng)者知情并簽訂知情同意書(shū)。96孔聚苯乙烯檢查板與KIM-1、胱抑素 C、叢生蛋白及 RBP、ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R＆D公司，其中試劑盒中配備有各種蛋白相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和牛血清白蛋白。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)自德國(guó)BMG公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 捐贈(zèng)者采集晨尿樣本50 mL于無(wú)菌的尿液采樣杯中。

1.2.2 樣本處理 尿液采集收集完畢后，即刻對(duì)樣本進(jìn)行分裝處理。樣本處理流程參照?qǐng)D1。所采集每份尿液50 mL充分混勻后，平均分成2部分，一部分經(jīng)二步離心(1 600 r/min離心10 min后12 000 r/min再高速離心10 min)，以去除細(xì)胞及微粒等殘?jiān)?；另一部分不?jīng)離心，直接進(jìn)行分裝。每部分樣本平均分裝成15管，每管1 mL，以進(jìn)行尿液室溫前處理時(shí)間穩(wěn)定性、4℃前處理時(shí)間穩(wěn)定性及－80℃反復(fù)凍融次數(shù)研究測(cè)試。其中10管樣本分別在室溫及 4 ℃條件下放置 4、12、24、48、72 h；4 管放置于－80℃冰箱進(jìn)行反復(fù)凍融測(cè)試，凍融次數(shù)分別為1、3、5、10次；另分別有 1管樣本，存放于－80℃作為項(xiàng)目對(duì)照樣本，即對(duì)照組(0 h)，在室溫處理檢測(cè)和凍融檢測(cè)中，分別與離心組、非離心組以及凍融檢測(cè)組樣本進(jìn)行比較。1管PBS作為陰性對(duì)照。處理完的樣本檢測(cè)前暫存放于－80℃冰箱保存。

圖1 尿液樣本處理流程

1.2.3 ELISA 用PBS分別將KIM-1、胱抑素C、叢生蛋白及RBP捕獲抗體蛋白稀釋為一定比例，并包被在96孔板中，室溫下孵化過(guò)夜。400 μL清洗液清洗每孔3次，加1%牛血清白蛋白稀釋液300 μL，室溫下孵化1 h。加入100 μL處理后的尿液樣本、試劑盒配備的標(biāo)準(zhǔn)品或陰性對(duì)照品到相應(yīng)孔位，室溫孵化2 h，洗板3次。KIM-1、胱抑素C、叢生蛋白及RBP相應(yīng)板中分別添加100 μL檢測(cè)抗體，室溫孵化2 h，洗板3次；加入100 μL鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶到每個(gè)孔；覆蓋后在室溫下避光孵化20 min，洗板3次。添加100 μL底物顯色液，室溫下避光孵化20 min；然后加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度值，根據(jù)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品光密度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出測(cè)試尿液樣本的蛋白質(zhì)量濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad軟件，室溫前處理時(shí)間穩(wěn)定性、4℃前處理時(shí)間穩(wěn)定性及－80℃反復(fù)凍融測(cè)試樣本與對(duì)照組間差異采用t檢驗(yàn)；如果數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以中位數(shù)[四分位數(shù)間距(25%，75%)]表示，2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同前處理方式對(duì)樣本質(zhì)量影響 與對(duì)照組比較隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)離心處理后的尿液樣本在室溫和4℃存放條件下，叢生蛋白質(zhì)量濃度呈降低趨勢(shì)，且在48 h顯著降低(t室溫＝3.005、P室溫＝0.023 9，t4℃＝3.232，P4℃＝0.017 9)；而其他 3 種蛋白質(zhì)量濃度無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖2。未經(jīng)離心處理的尿液樣本，室溫放置24 h后叢生蛋白質(zhì)量濃度即出現(xiàn)顯著降低(t＝2.574，P＝0.049 8)，4 ℃放置 72 h后也顯著降低(圖3)；其他3種蛋白質(zhì)量濃度無(wú)明顯變化。未經(jīng)離心的尿液樣本叢生蛋白的起始質(zhì)量濃度高于經(jīng)離心處理的樣本。

圖2 經(jīng)離心處理后的尿液叢生蛋白質(zhì)量濃度

圖3 未經(jīng)離心處理的尿液叢生蛋白質(zhì)量濃度

2.2 凍融次數(shù)對(duì)樣本質(zhì)量影響 相較離心處理樣本，未經(jīng)離心處理的 KIM-1(t＝2.063、P＝0.085)和叢生蛋白(t＝1.920、P＝0.103)的初始質(zhì)量濃度偏高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

尿液樣本在反復(fù)凍融1、3、5、10次后，4種蛋白質(zhì)量濃度均無(wú)顯著變化(圖4)。

表1 不同凍融次數(shù)尿液4種蛋白質(zhì)量濃度變化(pg/mL)

圖4 不同凍融次數(shù)尿液蛋白質(zhì)量濃度

3 討論

本研究中選用叢生蛋白、KIM-1、胱抑素C、RBP 4種蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)，研究不同處理方式對(duì)尿液樣本中蛋白質(zhì)量的影響。結(jié)果顯示，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，在室溫或4℃條件下放置的尿液樣本中，叢生蛋白質(zhì)量濃度有下降趨勢(shì)；經(jīng)離心處理的樣本，在室溫或4℃放置48 h后，叢生蛋白質(zhì)量濃度顯著降低。未經(jīng)離心處理的樣本，室溫放置24 h后，蛋白質(zhì)量濃度便出現(xiàn)顯著降低；4℃條件下蛋白相對(duì)穩(wěn)定，在放置72 h后顯著降低。對(duì)于離心/不離心處理的樣本，4℃相較于室溫，尿液蛋白更穩(wěn)定，質(zhì)量變化更小，更利于樣本質(zhì)量的保存。與叢生蛋白相比，其他3種蛋白相對(duì)穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)處理質(zhì)量濃度無(wú)明顯變化。4種蛋白－80℃反復(fù)凍融1、3、5、10次后，質(zhì)量濃度均無(wú)顯著變化，未經(jīng)離心處理樣本蛋白質(zhì)量濃度較離心處理樣本高。

總的來(lái)說(shuō)，放置溫度、時(shí)間及是否經(jīng)離心處理在一定程度上影響著尿液蛋白質(zhì)量的變化。然而，目前缺乏比較通用有效的生物標(biāo)志物實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，尿液樣本無(wú)法立即進(jìn)行分析處理；且對(duì)于檢測(cè)中心而言，并不是所有的檢測(cè)中心都建立了完善的檢測(cè)方法。因此，尿液樣本的暫存和運(yùn)輸在實(shí)際情況中通常無(wú)法避免。本研究對(duì)尿液樣本檢測(cè)前的前處理?xiàng)l件進(jìn)行了探索。

根據(jù)研究結(jié)果顯示，KIM-1、RBP、胱抑素C 3種蛋白標(biāo)志物無(wú)論是否經(jīng)過(guò)離心處理，在72 h以?xún)?nèi)處理對(duì)臨床結(jié)果無(wú)明顯影響。如果客觀檢測(cè)條件不能滿足，可暫且將尿液存放在4℃冷藏，72 h以?xún)?nèi)分析生物標(biāo)志物即可。如果涉及尿液樣本的運(yùn)輸，最好保證在室溫條件下不超過(guò)72 h。而叢生蛋白，穩(wěn)定性相對(duì)較差，最好在室溫24 h以?xún)?nèi)就處理，如果存放在4℃則可適度延長(zhǎng)至48 h以?xún)?nèi)處理。經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融10次，尿液中蛋白標(biāo)志物均未受明顯影響，因此尿液樣本可先在－80℃儲(chǔ)存，在長(zhǎng)期穩(wěn)定性有效期內(nèi)檢測(cè)即可。結(jié)合Adamo等[15]研究的長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果，叢生蛋白在－80℃條件下可儲(chǔ)存3個(gè)月，而KIM-1和胱抑素C在－80℃條件下可儲(chǔ)存達(dá)12個(gè)月。因此，可根據(jù)檢測(cè)需求及實(shí)際條件，確定樣本是否分裝及分裝管數(shù)等，在長(zhǎng)期穩(wěn)定性有效期內(nèi)對(duì)不同標(biāo)志性蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

4種蛋白中，叢生蛋白在不同放置溫度、時(shí)間下，尿液蛋白質(zhì)量濃度變化明顯，這一結(jié)果也與Adamo等[15]之前針對(duì)叢生蛋白的長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究結(jié)果一致。這可能是由叢生蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)造成的。叢生蛋白較RBP和胱抑素C小分子蛋白相對(duì)分子質(zhì)量偏大，且是由二硫鍵連接的異源二聚體蛋白，容易發(fā)生聚合形成二聚體、四聚體以及更高相對(duì)分子質(zhì)量的寡聚物，從而對(duì)以ELISA法為基礎(chǔ)的質(zhì)量濃度檢測(cè)造成影響[16]。叢生蛋白對(duì)存儲(chǔ)條件的變化敏感性高，因此該蛋白可作為尿液質(zhì)控的標(biāo)志性蛋白。

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Effects of pretreatment and freeze-thaw cycles on urinary biomarkers

LI Qiyuan， HE Xuheng， WANG Xian， LIU Xiaopan， SUN Jianbo， LIAO Qiuyan，YIN Jiefang， JIA Jia， TANG Zhongxiang， LI Xue
(China National GeneBank， BGI-Shenzhen， Shenzhen Guangdong 518083， China)

ObjectiveAimed to explore the effects of different pretreatment methods and freeze-thaw cycles on the quality of various urinary biomarkers.Methods Centrifuged or uncentrifuged urine samples were processed and stored at room temperature of 4℃ for 4，12，24，48 and 72 hours with freeze-thaw for 1， 3， 5， 10 cycles respectively.Then four urinary biomarkers including clusterin，kidney injury molecule 1(KIM-1)， cystatin C and retinol binding protein(RBP)were detected by enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA).Results After stored at room temperature for 48 hours，the clusterin biomarker from centrifuged urine samples showed a significant reduction in concentration.While for the uncentrifuged urine samples，the cluster in biomarker showed a significant reduction in concentration after stored at room temperature for 24 hours or 4℃for 72 hours.After multiple freeze-thaw cycles， all 4 urinary biomarkers were stable， and the initial concentrations were higher for those urinary biomarkers from uncentrifugated urine samples.Conclusion Before detection or cryopreservation，urine samples were recommended to store at 4℃for maximum period of 72 hours，and stored at room temperature for no more than 24 hours.No significant degradation was detected for the four urinary biomarkers after freeze-thaw for 10 cycles，and the urine samples could be aliquoted and freezed based on research requirements.

Urinary biomarkers； Urine storage； Biomarker quality

Q592.2

A

2095-3097(2017)05-0257-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.05.001

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20160510141910129)

518083廣東 深圳，深圳華大基因研究院國(guó)家基因庫(kù)(李啟沅，何旭珩，王 縣，劉小盼，孫建波，廖秋燕，尹潔芳，賈 佳，唐中湘，李 雪)

[注 明]李啟沅，何旭珩:并列第一作者

2017-03-13 本文編輯:徐海琴)