陸國(guó)弟 李成義 王惠珍 楊扶德 王明偉 沈俊忠

摘要：目的 采用指紋圖譜與一測(cè)多評(píng)相結(jié)合的方法測(cè)定掌葉大黃5種指標(biāo)性成分，分析比較甘肅不同產(chǎn)區(qū)、不同生長(zhǎng)年限掌葉大黃質(zhì)量，確定其最適種植區(qū)和最佳發(fā)展區(qū)。方法 采用藥典方法測(cè)定掌葉大黃含水量、總灰分、水溶性浸出物，HPLC測(cè)定5種指標(biāo)性成分，指紋圖譜與一測(cè)多評(píng)相結(jié)合評(píng)價(jià)15批掌葉大黃質(zhì)量。結(jié)果 15批掌葉大黃的含水量均小于15%，總灰分均小于10%，水溶性浸出物均大于25%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)；15批樣品指紋圖譜標(biāo)定共有峰23個(gè)，其中已確定成分蘆薈大黃素線(xiàn)性范圍0.012 2～0.734 4 ?g（r=0.999 9）、大黃酸線(xiàn)性范圍0.007 14～5.712 0 ?g（r=0.999 9）、大黃素線(xiàn)性范圍0.008 8～0.704 0 ?g（r=1.000 0）、大黃酚線(xiàn)性范圍0.122 4～3.672 0 ?g（r=0.999 9）、大黃素甲醚線(xiàn)性范圍0.014 8～5.920 0 ?g（r=0.999 7）；采用相對(duì)校正因子計(jì)算的含量值與實(shí)測(cè)值之間無(wú)顯著差異，建立的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好。甘肅產(chǎn)掌葉大黃質(zhì)量在不同產(chǎn)區(qū)、不同年限間存在顯著差異（P<0.05），其中禮縣上萍鄉(xiāng)、宕昌南河鄉(xiāng)茹樹(shù)村所產(chǎn)2年生掌葉大黃質(zhì)量最好，宕昌地區(qū)掌葉大黃3年生優(yōu)于2年生。結(jié)論 所建立的指紋圖譜和一測(cè)多評(píng)方法準(zhǔn)確、可行，可用于甘肅掌葉大黃質(zhì)量比較。各產(chǎn)區(qū)中，以禮縣和宕昌地區(qū)適宜種植及發(fā)展大黃產(chǎn)業(yè)，甘肅禮縣和宕昌地區(qū)2年生以上掌葉大黃適合藥用。

關(guān)鍵詞：掌葉大黃；指紋圖譜；一測(cè)多評(píng)法；質(zhì)量比較

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.014

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）10-0057-07

Analysis on Quality of Rheum Palmatum L. from Gansu Province Based on Multicriteria Method LU Guo-di1， LI Cheng-yi1， WANG Hui-zhen1， YANG Fu-de1， WANG Ming-wei1， SHEN Jun-zhong2 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Tanchang Science and Technology Bureau， Longnan 748500， China）

Abstract： Objective To compare the quality of Rheum palmatum L. in different areas and ages in Gansu Province by comparing five components in Rheum palmatum L. through fingerprints and QAMS （quantitative analysis of multi-components） methods； To determine the most suitable growing areas and the best development areas in Gansu Province. Methods The water content， total ashes， and water-soluble extract content in 15 batches of Rheum palmatum L. from different areas and ages in Gansu Province were determined according to the approaches listed in the Chinese Pharmacopeia. The contents of five index components were determined through HPLC and the quality of 15 batches of Rheum palmatum L were evaluated by fingerprint and QAMS method. Results The results from 15 batches of Rheum palmatum L. showed that the water content was less than 15%， total ashes less than 10%， and water-soluble extract content less than 25%， conforming to Pharmacopoeia. There were 23 common peaks in the fingerprints of 15 batches of Rheum palmatum L.. Five of them were identified as aloe-emodin， rhein， emodin， chrysophanol and physcion， which showed good linear relationship in the range of 0.012 2–0.734 4 ?g （r=0.999 9）， 0.007 14–5.712 0 ?g （r=0.999 9）， 0.008 8–0.704 0 ?g （r=1.000 0）， 0.122 4–3.672 0 ?g （r=0.999 9） and 0.014 8– 5.920 0 ?g （r=0.999 7）， respectively. There was no significant difference between the calculated value and the measured value by using the relative correction factor （RCF）， and the reproducibility of RCF was good. The quality of

基金項(xiàng)目：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年科研基金項(xiàng)目（2305016601）

通訊作者：王惠珍，E-mail：whz1974828@163.com

Rheum palmatum L. from different areas and ages in Gansu Province significantly differed （P<0.05）. Two year old Rheum palmatum L. from Pingxiang village of Li county and Rushu village of Tanchang county had the best quality， and that of three years old was better than two years old from Tanchang county. Conclusion The established fingerprints and QAMS method is accurate， feasible， and can be used for the quality comparison of Rheum palmatum L. from different areas and ages in Gansu Province. Li County and Tanchang County areas in Gansu Province can be used as suitable planting areas and development industry. Therefore， it is recommended to select more than two yeas old Rheum palmatum L. from Tanchang County and Li County in Gansu Province for medicinal application.

Key words： Rheum palmatum L.； fingerprints； QAMS； qualitative comparison

掌葉大黃Rheum palmatum L.為蓼科大黃屬植物，藥用其干燥根和根莖，含有多種化合物，包括蒽醌類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)、苯丁酮類(lèi)等，其中蒽醌類(lèi)成分是大黃的主要化學(xué)成分和生理活性物質(zhì)[1-2]，主要包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚5種，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)大黃藥材的質(zhì)量控制主要是這5種成分的總含量[3]。

掌葉大黃主產(chǎn)于甘肅，種植范圍較廣，但在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，各地忽略中藥材適宜種植區(qū)，盲目擴(kuò)種和引種，隨意跨范圍種植，導(dǎo)致品質(zhì)大打折扣，流通商品質(zhì)量參差不齊[4-5]。因此，本研究從甘肅不同產(chǎn)區(qū)采集15批掌葉大黃新鮮藥材，統(tǒng)一干燥處理，利用指紋圖譜和一測(cè)多評(píng)相結(jié)合[6]的方法，快速、全面分析比較其質(zhì)量，從而確定甘肅掌葉大黃最適種植區(qū)和最佳發(fā)展區(qū)。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)（路易公司，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD二極管陣列檢測(cè)器），Agilent1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，包括四元梯度泵、在線(xiàn)真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測(cè)器），Agilent1260高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD二極管陣列檢測(cè)器），色譜柱Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5 ?m），XS205DU型梅特勒-托利多分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司），BK8200HP型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器公司），Dragon-lab移液槍?zhuān)˙120048）。

對(duì)照品蘆薈大黃素（批號(hào)06714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、大黃酸（批號(hào)04X13，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、大黃素（批號(hào)09H13，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、大黃酚（批號(hào)04714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、大黃素甲醚（批號(hào)04714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%），西瑪試劑有限公司。甲醇為色譜純，純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

采集甘肅不同產(chǎn)區(qū)同年2年生或3年生新鮮掌葉大黃，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為掌葉大黃Rheum palmatum L.的根和根莖，統(tǒng)一進(jìn)行干燥，見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 水分測(cè)定

按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則0832項(xiàng)下烘干法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。15批大黃供試品水分含量均小于15.0%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 總灰分測(cè)定

按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則2302項(xiàng)下總灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。15批大黃供試品總灰分均未超過(guò)10.0%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 浸出物測(cè)定

參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則2201項(xiàng)下水溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下熱浸法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。15批大黃供試品水溶性浸出物含量均大于25.0%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 色譜條件 采用Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸水（B），線(xiàn)性梯度洗脫（0～15 min，40%A，60%B；15～30 min，50%A，50%B；30～50 min，60%A，40%B；50～80 min，80%A，20%B；80～95 min，100%A），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 ?L。

2.4.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品大黃素甲醚7.40 mg、大黃酚6.12 mg、大黃素0.88 mg、大黃酸7.14 mg、蘆薈大黃素1.53 mg，分別置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別配成5個(gè)對(duì)照品貯備液。分別精密量取大黃素甲醚、大黃酚、大黃素、大黃酸貯備液1 mL，蘆薈大黃素貯備液0.8 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成高濃度混合對(duì)照品溶液，再精密吸取1 mL高濃度混合對(duì)照品溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配成低濃度混合對(duì)照品溶液，將上述對(duì)照品貯備液、混合對(duì)照品溶液于4 ℃保存，備用。

2.4.3 供試品溶液制備 取樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.40 g，精密稱(chēng)定，置50 mL圓底燒瓶中，加入85%甲醇25 mL，回流提取30 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45 ?m濾膜過(guò)濾，即得。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取11號(hào)樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其指紋圖譜，記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積積分值，計(jì)算RSD，結(jié)果分別為0.22%、0.10%、0.25%、0.17%、0.30%。采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》計(jì)算指紋圖譜相似度，結(jié)果均相似度≥0.998，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取11號(hào)樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）各約0.4 g，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取10 ?L進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種成分峰面積積分值的RSD，結(jié)果分別為2.16%、0.84%、2.24%、1.72%、2.31%，指紋圖譜均相似度≥0.995。表明樣品處理方法的重復(fù)性較好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取11號(hào)供試品溶液10 ?L，分別于制備后的0、3、5、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種成分峰面積積分值的RSD分別為2.02%、0.77%、2.12%、1.64%、2.20%，指紋圖譜均相似度>0.995，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 共有模式建立及部分共有峰指認(rèn) 分別精密吸取1～15號(hào)供試品溶液10 ?L進(jìn)樣測(cè)定，并將其指紋圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，以11號(hào)樣品指紋圖譜作為參照譜，使用中位數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，加以多點(diǎn)校正，生成指紋圖譜共有模式，標(biāo)定共有峰23個(gè)（見(jiàn)圖1）。精密吸取混合對(duì)照品溶液10 ?L進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間及紫外吸收光譜圖比對(duì)，指認(rèn)指紋圖譜23個(gè)共有峰中的5種成分，分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4.8 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 以共有模式作為對(duì)照指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》對(duì)1～15號(hào)樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果1～15號(hào)樣品相似度良好，分別為0.927、0.926、0.959、0.961、0.929、0.864、0.906、0.955、0.926、0.973、0.883、0.847、0.827、0.879、0.916。

2.5 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定5種成分含量

2.5.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取低濃度和高濃度混合對(duì)照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 ?L，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量（?g）進(jìn)行回歸處理，得5種成分回歸方程及線(xiàn)性范圍。結(jié)果表明，各成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)表3。

2.5.2 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取11號(hào)樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）3份，各約0.2 g，置50 mL圓底燒瓶中，分別精密添加一定體積5種對(duì)照品貯備液，補(bǔ)充加入85%甲醇至25 mL，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算各成分加樣回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。5種成分回收率在95%～100%之間，表明本方法回收率良好。

2.5.3 相對(duì)校正因子的計(jì)算 取高濃度混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 ?L測(cè)定，以大黃素為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)校正因子。fs/i=fs/fi=（Ws×Ai）/（Wi×As），其中As為內(nèi)參物峰面積，Ws為內(nèi)參物質(zhì)量，Ai為待測(cè)成分對(duì)照品i峰面積，Wi為待測(cè)成分對(duì)照品i質(zhì)量。依據(jù)以上公式計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5.4 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 ?L，進(jìn)樣分析，考察不同實(shí)驗(yàn)室、不同液相、不同色譜柱、不同流速、不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果RSD均小于2.00%，見(jiàn)表6。表明在不同色譜系統(tǒng)、不同色譜柱及不同流速、不同柱溫條件下具有良好的重現(xiàn)性。

2.5.5 待測(cè)組分色譜峰定位 通過(guò)計(jì)算在不同色譜儀器或不同色譜柱中各待測(cè)成分色譜峰與大黃素色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間或保留時(shí)間差，對(duì)各待測(cè)成分進(jìn)行定位。結(jié)果表明各待測(cè)成分相對(duì)保留值RSD均小于3.04%，可以用于待測(cè)成分色譜峰的定位，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.5.6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 分別精密吸取1～15號(hào)供試品溶液10 ?L，注入高效液相色譜儀測(cè)定。采用外標(biāo)法測(cè)定掌葉大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種成分含量，再用建立的一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行含量計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表8、表9。用QAMS法及外標(biāo)法所測(cè)得的掌葉大黃中5種成分的含量基本一致，表明QAMS法在掌葉大黃多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用是可行的。

3 討論

本試驗(yàn)考察了提取溶劑甲醇濃度（50%、85%和100%）對(duì)掌葉大黃5種指標(biāo)性成分提取率的影響，結(jié)果表明，85%甲醇提取率最高，峰形較好且分離度好，雜質(zhì)較少?？疾斐暎?0、60 min）和回流（30、60 min）2種提取法對(duì)5種待測(cè)成分提取率的影響，結(jié)果表明，2種方法提取30 min即可提取完全，但回流提取率較超聲高，故提取方法最終確定為回流提取30 min。此外，本試驗(yàn)還考察不同色譜柱、不同色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間的影響，并以RSD作為指標(biāo)，結(jié)果表明，在上述條件下，相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間重現(xiàn)性良好。

本試驗(yàn)采集甘肅不同產(chǎn)區(qū)15批掌葉大黃進(jìn)行指紋圖譜標(biāo)定，發(fā)現(xiàn)15批掌葉大黃相似度在0.827以上，表明其相似度良好，說(shuō)明15批樣品采集區(qū)均可作為甘肅掌葉大黃的種植產(chǎn)區(qū)。

本試驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)2年生掌葉大黃進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明，甘肅所產(chǎn)掌葉大黃中以隴南產(chǎn)區(qū)（禮縣、宕昌縣）質(zhì)量最優(yōu)。其中禮縣上萍鄉(xiāng)、宕昌縣南河鄉(xiāng)茹樹(shù)村所產(chǎn)掌葉大黃質(zhì)量最好，其指標(biāo)性成分含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)（P<0.05）；岷縣種植基地、和政縣、宕昌縣獅子鄉(xiāng)為石村質(zhì)量最差，其含量顯著低于其他產(chǎn)區(qū)（P<0.05）。并由表8可知，影響大黃質(zhì)量最大的成分是大黃素甲醚。但各產(chǎn)地掌葉大黃中5種成分的含量與總成分含量呈現(xiàn)的趨勢(shì)并不一致，規(guī)律性不強(qiáng)。此外，宕昌縣南河鄉(xiāng)茹樹(shù)村、阿烏鄉(xiāng)哈達(dá)村及好梯鄉(xiāng)彭家山村所產(chǎn)掌葉大黃質(zhì)量?jī)?yōu)于禮縣銓水鄉(xiāng)、草坪鄉(xiāng)（P<0.05）。可考慮把宕昌縣南河鄉(xiāng)茹樹(shù)村、阿烏鄉(xiāng)哈達(dá)村及好梯鄉(xiāng)彭家山村作為甘肅掌葉大黃規(guī)模化發(fā)展的補(bǔ)充性產(chǎn)區(qū)。

本試驗(yàn)對(duì)宕昌縣3個(gè)種植區(qū)3年生掌葉大黃進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明，好梯鄉(xiāng)彭家山村所產(chǎn)大黃質(zhì)量最好，其含量顯著高于獅子鄉(xiāng)為石村、竹園鄉(xiāng)大草坡村（P<0.05），竹園鄉(xiāng)大草坡村所產(chǎn)大黃質(zhì)量最差，其含量顯著低于其他產(chǎn)區(qū)（P<0.05）。由表1推測(cè)可知，宕昌縣種植大黃的適宜海拔高度為2000～2300 m，超過(guò)2400 m或低于2000 m，都會(huì)使大黃藥材質(zhì)量下降，因?yàn)楹０卧礁?，氣溫越低，大黃比低海拔區(qū)域生長(zhǎng)緩慢，故同一生長(zhǎng)年限其質(zhì)量下降；而海拔低于2000 m，氣溫高，降水量少，也會(huì)影響其質(zhì)量。同時(shí)與產(chǎn)區(qū)土壤有關(guān)，獅子鄉(xiāng)和竹園鄉(xiāng)位于宕昌縣東南部，地形主要是深山峽谷，土壤石化嚴(yán)重，故會(huì)影響大黃質(zhì)量。

對(duì)宕昌縣4個(gè)種植區(qū)2年生掌葉大黃和3個(gè)種植區(qū)3年生掌葉大黃樣品指標(biāo)性成分含量分析發(fā)現(xiàn)，3年生優(yōu)于2年生，但目前市場(chǎng)上供應(yīng)的大黃藥材大多為2年生，為提高藥材質(zhì)量，建議甘肅規(guī)范化種植大黃將種植年限延長(zhǎng)到3年。

綜上所述，本試驗(yàn)所建立的指紋圖譜和一測(cè)多評(píng)方法準(zhǔn)確、可行，可用于甘肅不同產(chǎn)區(qū)、不同年限掌葉大黃質(zhì)量比較。同時(shí)，含量測(cè)定結(jié)果表明，甘肅所產(chǎn)掌葉大黃質(zhì)量?jī)?yōu)良，3年生優(yōu)于2年生，各產(chǎn)區(qū)中尤以禮縣和宕昌縣適宜種植大黃和發(fā)展大黃產(chǎn)業(yè)，但建議宕昌縣獅子鄉(xiāng)為石村和竹園鄉(xiāng)大草坡村應(yīng)加強(qiáng)栽培、管理技術(shù)，從而確保掌葉大黃質(zhì)量。

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（收稿日期：2016-11-14）

（修回日期：2016-12-08；編輯：陳靜）