王紅鋼， 張優(yōu)敬， 皇甫超申， 陳明亮， 王 軍， 吳東棟， 謝振興， 李彥章， 吉愛玲

(河南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院， 河南 開封 475004)

外源性硫化氫對小鼠原代肝細胞內(nèi)脂質(zhì)自噬分解的影響*

王紅鋼， 張優(yōu)敬， 皇甫超申， 陳明亮， 王 軍， 吳東棟， 謝振興， 李彥章△， 吉愛玲△

(河南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院， 河南 開封 475004)

目的研究硫化氫(H2S)供體GYY4137釋放的外源性H2S對小鼠原代肝細胞內(nèi)脂質(zhì)自噬分解的影響。方法采用2步原位灌流法分離C57BL/6小鼠原代肝細胞并分為4組：用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)正常組細胞；模型組用含1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h； H2S組和炔丙基甘氨酸(PAG)組則用1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后換無血清無酚紅的RPMI-1640培養(yǎng)液(同時分別給予1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG)處理6 h。收集各組細胞做LC3免疫熒光染色，拍攝熒光和相差圖片； Western blot檢測肝細胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ的蛋白表達量；透射電鏡觀察肝細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果和模型組相比，H2S組肝細胞內(nèi)LC3熒光顆粒和蛋白表達量增加，自噬溶酶體數(shù)量增加，細胞內(nèi)空泡增多。結(jié)論外源性H2S可促進脂肪變性肝細胞內(nèi)脂質(zhì)自噬分解。

硫化氫； 脂解； 肝細胞； 自噬

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是世界上常見的一種無過量飲酒史的肝病，它主要由脂肪在肝細胞中過度聚集導(dǎo)致[1]。在肝細胞中，有2條甘油三酯分解途徑，一是自噬分解途徑，另一條是胞質(zhì)分解途徑；肝細胞中脂質(zhì)自噬分解減弱是其脂肪變性的重要原因[2]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是哺乳動物體內(nèi)一種重要的氣體信號分子，它在哺乳動物體內(nèi)以半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產(chǎn)生[3]。研究表明，在正常生理條件下，外源性或內(nèi)源性硫化氫能影響肝脂質(zhì)代謝，其機制還不完全清楚[4]。在大鼠脂肪細胞中，抑制內(nèi)源性硫化氫的產(chǎn)生有利于胞質(zhì)的脂肪分解，升高血脂水平，促進非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生[5]。有報道，NaHS釋放硫化氫能促進脂質(zhì)分解，但NaHS能溶解于生理性緩沖液中，主要依靠化學平衡釋放硫化氫，其半衰期短，能迅速釋放硫化氫而不能長時間維持硫化氫的有效濃度，因此不算是一個真正的硫化氫供體[6]。GYY4137是一個新合成的硫化氫供體，能緩慢持續(xù)地釋放硫化氫[7]。因此，本文用GYY4137作為硫化氫的供體，用油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型，在體外研究外源性硫化氫對小鼠原代肝細胞中脂質(zhì)自噬分解的影響，為進一步研究外源性H2S在NAFLD的作用及H2S相關(guān)藥物研究提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1實驗動物

C57BL/6小鼠購于南京大學動物模型中心。動物合格證號為201401337，檢疫合格，體重 18～22 g。實驗動物選擇標準為4～6周齡雄性小鼠，毛發(fā)光亮無脫毛，四肢無缺陷，全身無畸形及腫塊，攝食、活動度、精神狀態(tài)良好。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及分組 按照Seglen的2步灌流法[8]分離小鼠原代肝細胞。實驗細胞分為4組：模型(model)組用含1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液孵育原代肝細胞48 h；對照(control)組給予等體積的培養(yǎng)液和10%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)；H2S組和炔丙基甘氨酸(propargylglycine，PAG)組是用含1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培養(yǎng)液孵育原代肝細胞48 h，然后換無血清無酚紅的RPMI-1640培養(yǎng)液的同時分別給予1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG處理6 h。

2.2油紅O染色 棄掉每孔中的培養(yǎng)液, PBS洗3遍, 然后用4%多聚甲醛固定10 min，37 ℃避光油紅O染色20 min， 再用50%異丙醇清洗20 s，雙蒸水洗3遍, 然后在倒置顯微鏡下拍照。

2.3MTT法檢測不同濃度油酸對小鼠原代肝細胞細胞活力的影響 將小鼠肝細胞以1×107/L的濃度接種于96孔板中，每孔0.2 mL，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，周邊孔不加液體以去除邊緣效應(yīng)，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液換為含不同油酸濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)肝細胞48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO振蕩5 min，然后在酶標儀上測定570 nm處的吸光度(A)值，細胞活性=處理組A值/對照組A值×100%。重復(fù)上述實驗3次。

2.4Western blot實驗 棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用冷PBS清洗細胞3遍，然后每孔加入200 μL RIPA裂解液，混勻后室溫靜置10 min，然后將細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，在冰上振蕩裂解5 min，然后12 000×g、4 ℃離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一個新的1.5 mL的離心管中，按照BCA試劑盒檢測蛋白濃度。檢測后的蛋白樣品用于做SDS-PAGE。膠放在轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min，然后組裝成“三明治”的形式，100 V電泳45～60 min，轉(zhuǎn)膜完成后取出PVDF膜，用TBS清洗10～15 min。LC3Ⅰ/Ⅱ Ⅰ抗用含有脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000)，加至PVDF膜室溫孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗PVDF膜 10 min、3次，再加入HRP標記的Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗PVDF膜10 min、3次，加入顯色液照相保存結(jié)果。

2.5免疫熒光檢測細胞內(nèi)LC3顆粒熒光 將細胞以每孔1×104接種于6 孔板中，用鼠尾膠原處理蓋玻片并將其置于孔內(nèi)。細胞分組處理完畢后，取出蓋玻片，用4%的多聚甲醛固定10 min后干燥，再用3 %的H2O2室溫孵育15 min，10% BSA 4 ℃封閉過夜，PBS沖洗5 min，洗3遍，在蓋玻片加100 μL LC3Ⅰ/Ⅱ工作液，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗5 min×3次，然后加FITC 標記的羊抗兔 IgG Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，雙蒸水沖洗后干燥，用硅油封片，DM2500熒光顯微鏡下拍照，上述實驗重復(fù)3次。同時用相差顯微物鏡拍攝同批次樣本相差圖像。

2.6透射電鏡標本的制備 收集細胞至 EP管內(nèi)，1 500×g離心3 min，棄上清，PBS洗2次， 2.5%戊二醛4 ℃避光固定過夜，再用2.5%戊二醛及1%鋨酸雙重固定，乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋后切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后透射電鏡下觀察、拍照。

3統(tǒng)計學處理

采用Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗分析2組均數(shù)間的差異，采用單因素方差分析檢驗3組和3組以上均數(shù)間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1MTT法確定誘導(dǎo)液中油酸的適宜濃度

為確定誘導(dǎo)液中合適的油酸濃度，本實驗用MTT測量不同濃度油酸誘導(dǎo)后肝細胞的活力，結(jié)果表明，誘導(dǎo)液中油酸濃度在0.8～1.2 mmol/L時，肝細胞活力較高，當誘導(dǎo)液中油酸的濃度大于1.2 mmol/L或小于0.8 mmol/L時，細胞活力明顯下降，見圖1。

Figure 1. Effect of different concentrations of oleic acid on the viability of mouse primary hepatocytes dectected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L oleic acid;#P<0.05vs1.2 mmol/L oleic acid.

圖1不同濃度油酸對肝細胞活性的影響

為確定1.2 mmol/L油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變的效果，本實驗用1.2 mmol/L 油酸誘導(dǎo)肝細胞48 h后進行油紅O染色，結(jié)果顯示細胞生長狀態(tài)依然良好，且肝細胞質(zhì)內(nèi)有大量脂滴積聚，提示肝細胞脂肪變性模型構(gòu)建成功，見圖2。

Figure 2. Lipid accumulation in hepatocytes induced by oleic acid (Oil red O stainning，×400). 1.2 mmol/L oleic acid induced hepatocytes for 48 h to establish the steatosis model, and then the cells were stained with Oil red O. The fat drops were indicated by arrow.

圖2油酸誘導(dǎo)肝細胞脂質(zhì)蓄積

2H2S影響肝細胞脂質(zhì)蓄積和空泡形成

用相差顯微鏡觀察肝細胞，脂滴顯示為黑點，胞漿內(nèi)處于降解階段的自噬體表現(xiàn)為形狀大小不同的空泡，空泡大小和數(shù)量較多可提示自噬的發(fā)生。結(jié)果表明對照組胞漿內(nèi)存在少量黑色斑點和少量小的空泡；模型組胞漿內(nèi)可見很多大小不同的黑色圓形脂滴，未見空泡；H2S組胞漿內(nèi)可見較多圓形空泡；而PAG組胞漿內(nèi)可見小的空泡，見圖3。

Figure 3. Effect of H2S on vacuoles in hepatocytes observed under phase-contrast microscope. The fat drops were indicated by thin arrow， and the autophagosomes were indicated by thick arrow.

圖3H2S對肝細胞質(zhì)空泡的影響

3H2S對肝細胞自噬標志物LC3熒光顆粒的影響

胞內(nèi)自噬體形成伴隨著微管相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ[9]，LC3-Ⅱ和降解底物一起與溶酶體融合，并在溶酶體內(nèi)被酸性水解酶降解，故LC3-Ⅱ被看作細胞自噬標志物。結(jié)果表明，LC3-Ⅰ在細胞質(zhì)內(nèi)彌散分布，LC3-Ⅱ聚集在自噬體膜上。對照組胞漿內(nèi)可見散在分布的LC3-Ⅰ熒光顆粒；模型組胞漿內(nèi)存在微弱散在分布的LC3-Ⅰ熒光。與模型組相比，H2S組胞漿內(nèi)存在較多的LC3-Ⅱ點狀熒光；而PAG組胞漿內(nèi)LC3-Ⅱ點狀熒光減少，見圖4。

4H2S對肝細內(nèi)LC3-Ⅱ的蛋白表達的影響

由于LC3-Ⅱ結(jié)合抗體的能力強于LC3-Ⅰ，故檢測敏感性高于LC3-Ⅰ，因此本文僅比較LC3-Ⅱ蛋白表達水平來評估自噬水平[10]。結(jié)果顯示，模型組胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達水平比對照組明顯下降。而H2S組胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達水平比對照組和模型組顯著升高，PAG組胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達水平比H2S組明顯降低，但比模型組顯著增高，見圖5。

5H2S影響肝細胞內(nèi)脂質(zhì)自噬體及自噬溶酶體

通過透射電鏡照片可知，對照組胞漿內(nèi)細胞器如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)正常，只有一些小的自噬體；模型組胞漿內(nèi)可見較多脂滴，線粒體體積變小，未見自噬體；H2S組胞漿內(nèi)自噬溶酶體較多，溶酶體內(nèi)脂質(zhì)和細胞器結(jié)構(gòu)模糊；PAG組胞漿內(nèi)有少量自噬體及脂質(zhì)空泡，存在少量自噬溶酶體,見圖6。

Figure 4. Effect of H2S on fluorescent particles of LC3 in hepatocytes LC3-Ⅰwhich were indicated by thin arrow scattered in the cytoplasm, LC3-Ⅱwhich were indicated by thick arrow gathered on the autophagosome membrane.

圖4H2S對肝細胞LC3熒光顆粒的影響

Figure 5. Effect of H2S on the expression of LC3-Ⅰand LC3-Ⅱin hepatocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsH2S group.

圖5H2S對肝細胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表達的影響

討 論

作為 一個核心代謝器官，肝臟在脂質(zhì)代謝中起重要作用，其功能異常可導(dǎo)致NAFLD。生理條件下，脂肪酸進入肝細胞內(nèi)，一方面促進甘油三酯合成，另一方面也促進胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)分解。少量脂滴激活自噬，將甘油三酯包裹在自噬體內(nèi)，然后在溶酶體酸性環(huán)境下降解[11]。過多脂滴蓄積在肝細胞內(nèi)可抑制脂質(zhì)自噬分解，導(dǎo)致肝細胞壞死或凋亡[12]。本研究結(jié)果表明， 1.2 mmol/L油酸可誘導(dǎo)肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量較大體積的脂滴，提示肝細胞發(fā)生了嚴重的脂肪變性。

Figure 6. Effect of H2S on ultrastructure of the hepatocytes obeserved under transmission electron microscope. The autophagosomes were indicated by arrows (×3 000).

圖6H2S對脂肪變性肝細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

GYY4137是一種新型H2S緩釋劑， 劑量高時有細胞毒作用，而劑量少時又不能顯著提高胞內(nèi)H2S水平[13]。本文結(jié)果表明劑量大于2 mmol/L的GYY4137可致細胞大量死亡，本文經(jīng)MTT實驗最后確定GYY4137適宜劑量為1 mmol/L，1 mmol/L GYY4137明顯增強細胞自噬，但無明顯細胞毒作用。本實驗使用內(nèi)源性H2S抑制劑PAG以觀察鼠體內(nèi)內(nèi)源性H2S減少時脂質(zhì)自噬分解的變化。

自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ。為研究H2S如何影響小鼠脂肪變性肝細胞內(nèi)脂質(zhì)自噬分解，本文用免疫熒光和Western blot檢測LC3-Ⅱ的表達。免疫熒光結(jié)果顯示，模型胞內(nèi)可見很少LC3-Ⅱ熒光亮點；和模型組相比，H2S組胞內(nèi)可見較多LC3-Ⅱ熒光亮點， Western blot結(jié)果表明，和模型組相比，H2S組LC3-Ⅱ蛋白表達量顯著增多，提示H2S可促進脂質(zhì)自噬。為進一步研究H2S如何影響脂質(zhì)自噬分解，本文又做電鏡實驗，在透射電鏡下可觀察到模型組胞漿內(nèi)存在大量脂滴，極少見自噬現(xiàn)象，提示大量脂質(zhì)可抑制脂質(zhì)自噬。H2S組細胞內(nèi)自噬體包裹脂滴，有較多自噬溶酶體處于降解階段，提示H2S可促進肝細胞脂質(zhì)自噬。和H2S組相比，模型組胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達顯著降低，提示脂質(zhì)自噬被抑制，而H2S組胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達明顯升高，再次提示H2S促進脂質(zhì)自噬。

綜上所述，嚴重的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積會抑制脂質(zhì)自噬分解；外源性給予H2S供體GYY4137能夠增強脂質(zhì)自噬分解。H2S可促進胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解，但對自噬分解途徑的影響少有研究，本文通過實驗初步得出結(jié)論：外源性H2S能促進胞內(nèi)脂質(zhì)自噬分解，從而為進一步研究H2S在脂代謝中的作用及NAFLD藥物治療提供了理論依據(jù)。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effectofexogenoushydrogensulfideonlipophagyinmouseprimaryhepatocytes

WANG Hong-gang, ZHANG You-jing, HUANGFU Chao-shen, CHEN Ming-liang, WANG Jun, WU Dong-dong, XIE Zhen-xing, LI Yan-zhang, JI Ai-ling

(BasicMedicalCollegeofHenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail:yanzhang@126.com； 10190011@henu.edu.cn)

AIM: To evaluate the effect of exogenous hydrogen sulfide (H2S) from GYY4137 on lipophagy in mouse primary hepatocytes.METHODSThe C57BL/6 mouse primary hepatocytes isolated and cultured by 2-stepinsituperfusion method were divided into 4 groups: the cells in control group were incubated with normal medium; the cells in model group were incubated with 1.2 mmol/L oleic acid (OA) for 48 h; the cells in H2S group or propargylglycine (PAG) group were incubated with 1.2 mmol/L OA for 48 h followed by serum-free phenol red-free RPMI-1640 medium which contained 1 mmol/L GYY4137 or 200 μmol/L PAG for 6 h. The cells were collected to conduct immunofluorescence staining of LC3 and photography under fluorescence microscope， phase-contrast microscope or transmission electron microscope. The protein expression of LC3-Ⅰ/Ⅱ in the hepatocytes was determined by Western blot.RESULTSIn contrast with the model group, the fluorescent particles of LC3, the protein expression of LC3, the number of autophagic lysosome and vacuoles in hepatocytes in H2S group increased.CONCLUSIONIn steatosis hepatocytes, exogenous H2S promotes the lipophagy.

Hydrogen sulfide; Lipolysis; Hepatocytes; Autophagy

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.028

1000- 4718(2017)10- 1901- 06

2017- 01- 16

2017- 04- 25

國家自然科學基金資助項目(No. 31300884)； 河南省高校重點科研項目(No. 16A310001)

△通訊作者 李彥章 Tel： 13592148745； E-mail： yanzhang@126.com； 吉愛玲 Tel： 0371-23880585； E-mail： 10190011@henu.edu.cn

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