劉黎瓊， 劉澤林， 崔海燕， 金夢(mèng)迪

(深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院血液科， 廣東 深圳 518052)

抑制mel18表達(dá)增強(qiáng)桂皮醛誘導(dǎo)的HL60細(xì)胞分化*

劉黎瓊△， 劉澤林， 崔海燕， 金夢(mèng)迪

(深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院血液科， 廣東 深圳 518052)

目的研究下調(diào)mel18基因表達(dá)對(duì)桂皮醛(CA)誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化的影響。方法用低濃度CA和反式維甲酸(ATRA)處理HL60細(xì)胞。用shRNAmel18質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒shRNALuc包裝慢病毒，用病毒感染HL60細(xì)胞。低濃度CA和ATRA作用于病毒感染的HL60細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞表面分化抗原表達(dá)，Western blot法檢測(cè)MEL18蛋白、cyclin D1、p27的表達(dá)和Akt的磷酸化水平。結(jié)果低濃度CA和ATRA增加HL60細(xì)胞的粒細(xì)胞分化抗原CD11b表達(dá)，MEL18蛋白表達(dá)下降。shmel18病毒感染的HL60細(xì)胞(shmel18-HL60細(xì)胞)MEL18蛋白表達(dá)下降，而對(duì)照病毒感染的HL60細(xì)胞(shLuc-HL60細(xì)胞)MEL18蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。shmel18-HL60細(xì)胞的CD11b表達(dá)率明顯增高，細(xì)胞阻滯于G1期；經(jīng)低濃度CA處理后，shmel18-HL60細(xì)胞的CD11b表達(dá)率進(jìn)一步增高。shmel18-HL60細(xì)胞Akt的磷酸化水平及cyclin D1表達(dá)明顯下降，而p27表達(dá)則顯著升高。結(jié)論抑制mel18基因表達(dá)導(dǎo)致HL60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞方向分化，mel18基因可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)途徑調(diào)控cyclin D1和p27的表達(dá)，影響HL60細(xì)胞分化。而CA可能通過(guò)抑制mel18基因表達(dá)從而通過(guò)PI3K/Akt途徑促進(jìn)HL60細(xì)胞分化。

桂皮醛；mel18基因； HL60細(xì)胞； 細(xì)胞分化； PI3K/Akt信號(hào)通路

桂皮醛(cinnamaldehyde，CA)是肉桂的主要活性成分，廣泛用于食品原料和臨床抗炎用藥。我們研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的CA可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡，而較低濃度的CA可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞周期阻滯和分化[1-2]。多梳家族蛋白(Polycomb-group proteins，PcG)成員MEL18與造血細(xì)胞的分化密切相關(guān)，我們研究發(fā)現(xiàn)CA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562分化伴MEL18表達(dá)改變[3-4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，抑制mel18基因表達(dá)可誘導(dǎo)急性髓系白血病HL60細(xì)胞分化并促進(jìn)NB4細(xì)胞PML-RARα蛋白降解[5-6]。為探討mel18基因在白血病細(xì)胞分化中的作用及分子機(jī)制，并進(jìn)一步明確CA誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞分化的機(jī)制，本研究以反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)為誘導(dǎo)分化劑陽(yáng)性對(duì)照，從細(xì)胞周期、分化和信號(hào)通路等多方面研究mel18基因在CA誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，為對(duì)白血病細(xì)胞分化受阻分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)和腫瘤治療開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1主要試劑

急性髓系白血病細(xì)胞HL60和病毒包裝細(xì)胞293T來(lái)源于華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院；RPMI-1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自HyClone；CA(分子式C9H8O，分子量132.16，純度>95%)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人CD14單克隆抗體以及藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗人CD11b和CD14單克隆抗體(CD14-FITC、 CD11b-PE和CD14-PE)購(gòu)自BD；兔抗人MEL18和p27多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；兔抗人cyclin D1多克隆抗體、抗磷酸化和非磷酸化Akt多克隆抗體、兔抗人蛋白內(nèi)參照GAPDH、 II 抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Cell Signaling；ATRA、嘌呤霉素、碘化丙啶和ECL試劑盒購(gòu)自 Sigma；pGFP-C-shLenti慢病毒載體shRNAmel18質(zhì)粒、空載體質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒均購(gòu)自O(shè)riGene；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Invitrogen。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HL60細(xì)胞株和293T細(xì)胞分別采用含有 10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2.2慢病毒包裝、感染HL60細(xì)胞以及干擾效率的檢測(cè) 根據(jù)說(shuō)明書操作。shRNAmel18質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒shRNALuc轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒，熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。72 h收集病毒，感染HL60細(xì)胞。獲得shmel18病毒感染的HL60細(xì)胞(shmel18-HL60細(xì)胞)和對(duì)照病毒shLuc感染的HL60細(xì)胞(shLuc-HL60細(xì)胞)。4 d后用Western blot檢測(cè)MEL18蛋白的表達(dá)情況，以評(píng)估shRNA的干擾效率。

2.3誘導(dǎo)細(xì)胞分化 1 μmol/L ATRA可有效誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化[7]，我們前期研究顯示終濃度為20 μmol/L CA也可有效誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化。在6孔板中以2×108/L密度(細(xì)胞活性大于98%)接種shmel18-HL60細(xì)胞和shLuc-HL60細(xì)胞，以1 μmol/L ATRA為分化誘導(dǎo)劑陽(yáng)性對(duì)照，加入CA(終濃度為20 μmol/L)處理72 h。收集ATRA或CA處理72 h 的HL60細(xì)胞、shmel18-HL60細(xì)胞和shLuc-HL60細(xì)胞，連同CA和ATRA未處理(control)組細(xì)胞，PBS漂洗后，加入1 μL 熒光標(biāo)記的CD11b 抗體或CD14 抗體，室溫避光靜置20 min，用PBS漂洗后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4細(xì)胞周期的檢測(cè) 收集ATRA或CA處理72 h 的shmel18-HL60細(xì)胞和shLuc-HL60細(xì)胞，連同CA和ATRA未處理組細(xì)胞，PBS漂洗后用70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜。冷PBS充分漂洗后加入細(xì)胞周期染液(含PI 30 μg/L和RNase 5 mg/L)，4 ℃避光過(guò)夜，次日上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS漂洗后離心收集細(xì)胞，裂解、吸上清、測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。30 μg總蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h。將 I 抗抗體與膜孵育4 ℃過(guò)夜后，將 II 抗與膜室溫孵育1 h，ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

FlowJo 7.6.1軟件分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA) ，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1CA誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化伴MEL18蛋白表達(dá)下調(diào)

HL60細(xì)胞經(jīng)ATRA和CA作用后，粒細(xì)胞分化抗原CD11b表達(dá)率增高，伴MEL18蛋白表達(dá)降低，見(jiàn)圖1。

2shmel18-HL60細(xì)胞MEL18蛋白表達(dá)下降

shmel18-HL60和shLuc-HL60細(xì)胞有效感染率都大于50%。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未感染病毒的HL60細(xì)胞(control組)表達(dá)MEL18蛋白,經(jīng)病毒感染后，shLuc-HL60細(xì)胞中MEL18蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，而shmel18-HL60細(xì)胞MEL18蛋白表達(dá)顯著受抑制，見(jiàn)圖2。

Figure 1. The effects of CA or ATRA on differentiation of HL60 cells (A) and the expression of MEL18 in the HL60 cells (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1CA或ATRA對(duì)HL60細(xì)胞分化及MEL18表達(dá)的影響

Figure 2. The results of Western blot for determining the expression of MEL18 in the HL60 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2Westernblot檢測(cè)MEL18的表達(dá)情況

3下調(diào)mel18表達(dá)增強(qiáng)HL60細(xì)胞分化

與shLuc-HL60細(xì)胞相比，shmel18-HL60細(xì)胞的粒細(xì)胞分化抗原CD11b表達(dá)率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。經(jīng)ATRA和CA誘導(dǎo)分化后，shmel18-HL60細(xì)胞CD11b表達(dá)率進(jìn)一步增高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。經(jīng)ATRA和CA處理前后，shLuc-HL60和shmel18-HL60細(xì)胞表面CD14抗原表達(dá)無(wú)明顯改變。

4下調(diào)mel18對(duì)HL60細(xì)胞周期的影響

shmel18-HL60細(xì)胞G1期細(xì)胞的比例明顯高于shLuc-HL60細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示抑制mel18基因表達(dá)后HL60細(xì)胞周期受阻滯于G1期。經(jīng)ATRA和CA誘導(dǎo)分化后的shmel18-HL60細(xì)胞G1期細(xì)胞的比例進(jìn)一步增高，見(jiàn)圖4。

5PI3K/Akt信號(hào)通路下游蛋白活性的改變

shmel18-HL60細(xì)胞中磷酸化Akt活性明顯低于shLuc-HL60細(xì)胞， PI3K/Akt信號(hào)通路下游基因cyclin D1蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，而p27表達(dá)則顯著升高。ATRA和CA處理shmel18-HL60和shLuc-HL60細(xì)胞，均使cyclin D1表達(dá)下降而p27表達(dá)增加。ATRA和CA誘導(dǎo)分化后，shmel18-HL60細(xì)胞磷酸化Akt活性和cyclin D1表達(dá)進(jìn)一步降低，p27表達(dá)進(jìn)一步增加，見(jiàn)圖5。

Figure 3. The expression of CD11b in the HL60 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshLuc-HL60 control group;△△P<0.01vsshmel18-HL60 control group.

圖3HL60細(xì)胞CD11b表達(dá)水平的比較

Figure 4. The cell cycle distribution in the HL60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsshLuc-HL60 control group;△P<0.05vsshmel18-HL60 control group.

圖4HL60細(xì)胞細(xì)胞周期分布的變化

Figure 5. The phosphorylation level of Akt and the protein expression of cyclin D1 and p27 in the HL60 cells. A: shLuc-HL60 control; B: shLuc-HL60 cells treated with 1 μmol/L ATRA; C: shLuc-HL60 cells treated with 20 μmol/L CA; D: shmel18-HL60 control; E: shmel18-HL60 cells treated with 1 μmol/L ATRA; F: shmel18-HL60 cells treated with 20 μmol/L CA. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsA group;△P<0.05，△△P<0.01vsD group.

圖5HL60細(xì)胞Akt磷酸化水平以及cyclinD1和p27蛋白表達(dá)的變化

討 論

白血病是最常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，白血病細(xì)胞分化受阻，誘導(dǎo)分化成為白血病治療的一個(gè)重要方向。明確白血病細(xì)胞分化受阻機(jī)制和篩選安全有效的誘導(dǎo)分化劑是誘導(dǎo)分化治療的重要基礎(chǔ)。從傳統(tǒng)中藥中篩選具有抗白血病作用的有效成分和有關(guān)白血病誘導(dǎo)分化的研究引起廣泛關(guān)注。我們研究發(fā)現(xiàn)，食用香料肉桂的主要活性成分CA較低濃度時(shí)可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞細(xì)胞周期停滯、分化，而對(duì)來(lái)自健康供者的正常骨髓和造血干祖細(xì)胞無(wú)明顯毒性[1-2]。這提示桂皮醛可能成為白血病安全有效的誘導(dǎo)分化劑，因此有必要深入研究其誘導(dǎo)分化效應(yīng)的機(jī)制。

MEL18是PcG成員。關(guān)于mel18基因在腫瘤發(fā)病中的作用一直存在爭(zhēng)議：mel18基因表達(dá)于正常乳腺組織，而在乳腺癌原代標(biāo)本中低表達(dá)或不表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞mel18基因的表達(dá)，可降低乳腺癌細(xì)胞的Akt/PKB活性，降低原癌基因c-myc的表達(dá)[8-9]；然而，MEL18蛋白在Hodgkin淋巴瘤原代標(biāo)本有非常高的陽(yáng)性表達(dá)率，低氧誘導(dǎo)生發(fā)中心B細(xì)胞-彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SUDHL4 和SUDHL6 的MEL18表達(dá)增加[10-11]；mel18基因在急性髓細(xì)胞白血病原代細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)[12]；Jo等[5-6]發(fā)現(xiàn)敲除mel18基因可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞HL60向粒細(xì)胞分化，促進(jìn)NB4細(xì)胞PML-RARA蛋白降解。以上研究提示mel18基因雖然在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，但其在血液腫瘤中可能發(fā)揮相反作用，因此，進(jìn)一步研究mel18基因在白血病分化中的作用和機(jī)制非常有意義。

我們之前的研究顯示，CA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562分化伴mel18基因表達(dá)增高。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，CA及促分化劑ATRA誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化時(shí)MEL18蛋白表達(dá)減弱，這可能是因細(xì)胞株不同而異。敲除mel18基因使HL60細(xì)胞MEL18蛋白表達(dá)下降，可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞HL60向粒細(xì)胞分化，這與Jo等[5]研究結(jié)果一致。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)，CA和ATRA均可進(jìn)一步增加敲除mel18基因的HL60細(xì)胞粒細(xì)胞分化抗原表達(dá)及細(xì)胞周期受阻于G1期。這提示mel18基因本身阻礙HL60細(xì)胞分化，抑制mel18基因?qū)е翲L60細(xì)胞分化，并促進(jìn)ATRA及CA誘導(dǎo)的HL60細(xì)胞分化，細(xì)胞周期停滯于G1期。

細(xì)胞周期與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)，cyclin D1蛋白降低可延長(zhǎng)細(xì)胞G1期，p27阻止細(xì)胞通過(guò)G1/S期轉(zhuǎn)換，cyclin D1和p27為Akt下游靶點(diǎn)[13-14]。mel18基因阻斷Akt介導(dǎo)的p27核定位，使乳腺癌細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G1期，發(fā)揮抑癌作用[15]。我們研究結(jié)果顯示：下調(diào)mel18、ATRA和CA誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化均使細(xì)胞周期受阻于G1期，并下調(diào)磷酸化Akt活性和cyclin D1表達(dá)，上調(diào)p27表達(dá)；當(dāng)ATRA、CA分別與shmel18聯(lián)用時(shí)誘導(dǎo)分化效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。這說(shuō)明mel18基因在白血病細(xì)胞HL60發(fā)揮促癌基因作用，抑制mel18基因表達(dá)有助于白血病細(xì)胞HL60向成熟方向分化，mel18基因可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)途徑調(diào)控cyclin D1和p27，影響白血病細(xì)胞分化。而CA可能通過(guò)抑制mel18基因表達(dá)從而通過(guò)Akt途徑促進(jìn)白血病細(xì)胞分化，發(fā)揮抗白血病作用。

綜上所述，CA可能通過(guò)下調(diào)mel18基因表達(dá)來(lái)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性，從而影響細(xì)胞周期相關(guān)分子cyclin D1和p27的表達(dá)，使細(xì)胞周期受阻于G1期，使HL60細(xì)胞分化。這進(jìn)一步闡明了白血病分化受阻的機(jī)制，為抗白血病新藥開(kāi)發(fā)積累更多理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲, 羅 森)

Suppressionofmel18enhancesdifferentiationofacutemyeloidleukemiacelllineHL60inducedbycinnamaldehyde

LIU Li-qiong, LIU Ze-lin, CUI Hai-yan, JIN Meng-di

(DepartmentofHematology,ShenzhenNanshanHospital,Shenzhen518052,China.E-mail:llqwsp@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of suppression ofmel18 gene on the differentiation of human acute myeloid leukemia cell line HL60 induced by cinnamaldehyde (CA).METHODSHL60 cells were treated with low concentration of CA or all-transretinoic acid (ATRA). shRNAmel18 vector and shRNALuc control vector were employed to package lentiviruses which were then used to infect HL60 cells. The virus-infected HL60 cells were treated with low concentration of CA, and ATRA was used as a positive control of differentiation-inducing agent. The differentiation markers on the cell surface and cell cycle of virus-infected HL60 cells were analyzed by flow cytometry. Western blot was used to determine the expression of MEL18, cyclin D1 and p27, as well as the phosphorylation level of Akt.RESULTSLow concentration of CA and ATRA increased the expression of granulocytic differentiation marker CD11b on the HL60 cells, with the decreased expression of MEL18 in the HL60 cells. The expression of MEL18 decreased in shmel18 virus-infected HL60 cells (shmel18-HL60 cells)， but did not change in shLuc-HL60 cells. The expression of CD11b on shmel18-HL60 cells increased with G1-phase arrest, which went even higher after treatment with CA. The phosphorylation level of Akt and the expression of cyclin D1 decreased in shmel18-HL60 cells with the increase in the expression of p27.CONCLUSIONInhibition ofmel18 gene leads HL60 cell granulocytic differentiation.mel18 gene may affect the differentiation of HL60 cells by regulating cyclin D1 and p27 via PI3K/Akt signaling pathway. PI3K/Akt signaling pathway is also involved in CA-induced differentiation of HL60 cells by suppressingmel18 gene expression.

Cinnamaldehyde;mel18 gene; HL60 cells; Cell differentiation; PI3K/Akt signaling pathway

R329.21; R733.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.019

1000- 4718(2017)10- 1852- 06

2016- 08- 25

2017- 08- 01

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2016A030313032)；深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No. JCYJ20160429182558793)；深圳市科技局資助項(xiàng)目(No. 201303188)；深圳市南山區(qū)衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2015001)

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