李環(huán)++孫炳丞++劉磊++鞏旭燕++歐薩瑪++侯玉霞

[摘要]目的：探討雌激素對(duì)SD大鼠頦舌肌功能影響的中樞途徑。方法：選取7周齡雌性SD大鼠50只，隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、100nmol組、1μmol組、2μmol組。利用腦立體定位圖譜確定第四腦室及舌下神經(jīng)核團(tuán)位置，通過(guò)第四腦室注射溶液建立不同水平的雌激素模型，使用玻璃微電極檢測(cè)舌下神經(jīng)核團(tuán)放電特征，BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)SD大鼠頦舌肌肌電活性。結(jié)果：舌下神經(jīng)核放電頻率及幅值：空白組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；2μmol組>1μmol組>100nmol組>對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。電生理檢測(cè)顯示：各組大鼠頦舌肌動(dòng)作電位幅值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。肌電活性（平均頻率、最大頻率、積分幅度、最大幅值）：空白組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05），2μmol組>1μmol組>100nmol組>對(duì)照組，組間具有極顯著性差異（P<0.001）。結(jié)論：隨著雌激素水平升高，舌下神經(jīng)核自發(fā)放電水平增強(qiáng)，頦舌肌肌電活性增強(qiáng)，雌激素可通過(guò)中樞途徑調(diào)節(jié)頦舌肌生物學(xué)功能。

[關(guān)鍵詞]阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征；雌激素；舌下神經(jīng)核；電生理；頦舌肌

[中圖分類號(hào)]Q579.1+3 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）09-0045-03

The Study of Estrogen Effect on Rat Genioglossus Physiological Function by

Central Pathway

LI Huan，SUN Bing-cheng， LIU Lei，GONG Xu-yan， OU Sa-ma， HOU Yu-xia

（Department of Orthodontics， Stomatology Hospital of Xian Jiaotong University， Xian 710004，Shaanxi， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of estrogen on central pathway of genioglossus muscle function in SD female rats. Methods Fifty female SD rates of 7-week old were randomly divided into five groups blank group，control group，100nmol group， 1μmol group and 2μmol group.The location of the fourth ventricle and hypoglossal nucleus was determined by stereotaxic localization of the brain.Different levels of estrogen were injected to the fourth ventricle of the animal models. Hypoglossal nerve nuclei electrical discharges were detected using glass microelectrode. Genioglossus muscle activity was detected by using BL-420E+ biological experimental system. Results There was no significant difference between the blank group and the control group in the discharge frequency and amplitude of hypoglossal nucleus （P>0.05）， while 2 μmol group is greater than 1μmol group， 100 nmol group than control group but lower than 1μmol group .No significant changes of action potential amplitude were observed among five groups （P>0.05）. It had no significant difference between the blank group and the control group of the EMG activity （average frequency， maximum frequency， integral amplitude and maximum amplitude） （P>0.05）， while 100nmol group was higher than control group （P<0.001）， 1μmol group than 100nmol group （P<0.001）， but lower than 2μmol group （P<0.001）. Conclusion With elevated estrogen levels， electrical discharge level of hypoglossal nerve nucleus was enhanced， and genioglossus muscle electromyographic activity was improved. Estrogen could modulate genioglossus biological function through the central pathway.

Key words：obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome； estrogen； hypoglossal nucleus； electrophysiology； genioglossus

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（Obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是一種常見(jiàn)且具有一定潛在危險(xiǎn)的睡眠障礙性疾病，主要表現(xiàn)為睡眠中反復(fù)出現(xiàn)上氣道阻塞，導(dǎo)致以呼吸停止或低通氣為特征的呼吸紊亂現(xiàn)象[1]。頦舌肌是維持上氣道通暢的關(guān)鍵肌肉，被稱為上氣道的“安全肌”[2-3]。舌下神經(jīng)核是頦舌肌的支配核團(tuán)，位于第四腦室底延髓后段，支配頦舌肌的節(jié)律運(yùn)動(dòng)與緊張性收縮，維持上呼吸道的穩(wěn)定性[4]。流行病學(xué)調(diào)查顯示男性發(fā)病率約為女性的2～3倍[5-7]，絕經(jīng)后女性發(fā)病率明顯高于絕經(jīng)前，給予雌激素替代治療（HRT）后OSAHS的發(fā)病率有所降低[8]。提示雌激素在預(yù)防或減少OSAHS的發(fā)病中，可能具有一定的保護(hù)作用。Shortt CM等[9]研究表明，雌激素能夠提高慢性間歇低氧環(huán)境下去卵巢大鼠頦舌肌的抗疲勞性。大鼠舌下神經(jīng)核內(nèi)存在雌激素受體[10-11]，提示舌下神經(jīng)核是雌激素的潛在靶組織，雌激素可能通過(guò)舌下神經(jīng)核間接影響頦舌肌功能。而Shortt CM等研究并未從舌下神經(jīng)核深入研究雌激素影響頦舌肌功能的中樞機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變SD大鼠顱內(nèi)雌激素水平，檢測(cè)雌激素對(duì)舌下神經(jīng)核放電特征及頦舌肌肌電活性的影響，從中樞途徑探討雌激素對(duì)頦舌肌功能影響的生物學(xué)機(jī)制，為OSAHS的臨床預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7周齡雌性SD大鼠（體質(zhì)量300±25g）50只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（陜）2012-003。

1.1.2 主要試劑和儀器：10%水合氯醛（上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司）、2%膀胺天藍(lán)（美國(guó)Sigma公司）、17β-雌二醇（美國(guó)Cayman公司）、人工腦脊液（ACSF，pH：7.2～7.4，自己配制）、大鼠腦立體定位儀（DW-2000，成都泰盟軟件有限公司）、顱內(nèi)注射導(dǎo)管（深圳瑞沃德生命科技有限公司）、微電極（MP-300，成都泰盟軟件有限公司）、生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)BL-420（成都泰盟軟件有限公司）、哺乳類動(dòng)物手術(shù)器械（上海浦夏醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 顱內(nèi)第四腦室注射雌激素：腹腔注射10%水合氯醛（0.4ml/100g）麻醉大鼠，采取俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，鼻尖正中，提尾不掉。暴露前囟和人字縫，后緣暴露至正邊緣，調(diào)節(jié)前囟與人字縫，使兩點(diǎn)垂直高度一致，矢狀縫居中。第四腦室定位：前囟后12.8mm、囟門腹側(cè)6.2mm做標(biāo)記，去骨及硬腦膜。放置套管，尖端到達(dá)囟門腹側(cè)6.2mm的位置后，固定套管。實(shí)驗(yàn)組按照注射雌激素濃度不同分為：100nmol組、1μmol組、2μmol組[13]，分別注射1μl雌激素溶液；對(duì)照組注射1μl人工腦脊液；空白組不注射。

1.2.2 舌下神經(jīng)核團(tuán)放電檢測(cè)：核團(tuán)定位：人字縫點(diǎn)后（4.900±0.020）mm、旁開（0.100±0.020）mm、囟門腹側(cè)（8.646±0.385）mm做標(biāo)記，鉆孔，滴入溫?zé)崾炗椭溜B骨表面。安放玻璃微電極：依據(jù)監(jiān)聽器的聲音變化及監(jiān)視器的顯示基線出現(xiàn)突然變細(xì)現(xiàn)象，判斷電極尖端進(jìn)入石蠟油與空氣相交界面，高度記錄為0，將微電極緩慢推送至8000μm處出現(xiàn)電信號(hào)或者電位變化，再推進(jìn)200μm左右觀察到舌下神經(jīng)核神經(jīng)元自發(fā)簇發(fā)性放電特性，平穩(wěn)后記錄保存。

1.2.3 頦舌肌電生理檢測(cè)：舌下神經(jīng)核放電檢測(cè)結(jié)束后，鈍性分離暴露頦舌肌。用BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)SD大鼠頦舌肌進(jìn)行肌電檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)為：動(dòng)作電位、平均頻率、最大頻率、積分幅度、最大幅值。

1.2.4 核團(tuán)位點(diǎn)驗(yàn)證：頦舌肌肌電檢測(cè)后，用標(biāo)記儀連接電極及大鼠頭部皮膚，給予15V電壓，電泳膀胺天藍(lán)溶液至記錄位點(diǎn)10min后拔針。灌注固定取材，確定記錄位置：冰凍切片、HE染色后顯微鏡下觀察記錄位點(diǎn)，對(duì)照腦立體定位圖譜，觀察染料是否在舌下神核內(nèi)（圖5）。如記錄位點(diǎn)未在舌下神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)，則放棄數(shù)據(jù)，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所得數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析（ANOVA）比較多組均數(shù)，SNK-q檢驗(yàn)法比較組間均數(shù)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌激素對(duì)SD大鼠舌下神經(jīng)核電生理影響：舌下神經(jīng)核放電頻率及幅值：空白組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；2μmol組>1μmol組>100nmol組>對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨雌激素濃度增加，核團(tuán)放電頻率加快，幅值增大（表1，圖1）。

2.2 舌下神經(jīng)核團(tuán)電生理學(xué)改變對(duì)SD大鼠頦舌肌功能影響

2.2.1 頦舌肌在電刺激下，產(chǎn)生動(dòng)作電位幅值的檢測(cè)結(jié)果顯示：各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2），排除了頦舌肌本身功能異常對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響的可能。

2.2.2 頦舌肌肌電活性（平均頻率、最大頻率、積分幅度、最大幅度）檢測(cè)結(jié)果顯示：空白組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05），2μmol組>1μmol組>100nmol組>對(duì)照組，組間具有極顯著性差異（P<0.001）。頦舌肌肌電活性隨舌下神經(jīng)核自發(fā)放電頻率及幅值升高（顱內(nèi)雌激素水平升高）而升高（表2，圖3，圖4）

2.3 舌下神經(jīng)核團(tuán)定位：舌下神經(jīng)核記錄位點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果：人字縫點(diǎn)后（4.900±0.020）mm、旁開（0.100±0.020）mm、囟門腹側(cè)（8.646±0.385）mm，玻璃微電極尖端位于舌下神經(jīng)核內(nèi)部（圖5）。

3 討論

雌激素是一種脂溶性類固醇激素，主要由卵巢合成。正常大鼠血清雌激素水平隨動(dòng)情周期發(fā)生變化。雌性大鼠中，雌二醇的基礎(chǔ)水平為18.4～135.8pmol/L，在動(dòng)情前期達(dá)到146.8～367pmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素濃度遠(yuǎn)高于生理濃度時(shí)才能誘導(dǎo)雌激素的非基因組效應(yīng)[12]。本研究探討雌激素能否從中樞途徑快速影響頦舌肌肌電效應(yīng)，因此設(shè)計(jì)的雌激素最低濃度為100nmol。聶培鶴等[13]在顱內(nèi)微注射雌激素，發(fā)現(xiàn)隨雌激素濃度（0.1～1μmol/L）增加，大鼠內(nèi)臟反應(yīng)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)。

本研究利用此動(dòng)物模型，采用第四腦室注射不同濃度雌激素溶液，研究雌激素調(diào)節(jié)大鼠頦舌肌生理功能的中樞途徑。研究發(fā)現(xiàn)，注射不同濃度的雌激素藥液后20min，SD大鼠舌下神經(jīng)核的電生理狀況發(fā)生改變，且隨著雌激素濃度升高，舌下神經(jīng)核自發(fā)放電頻率和最大幅值明顯升高。雌激素通過(guò)血液循環(huán)與靶細(xì)胞雌激素受體結(jié)合，可快速（幾秒鐘至數(shù)分鐘）發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，該途徑稱為膜啟動(dòng)的類固醇信號(hào)傳導(dǎo)（membrane initiated steroid signaling， MISS）[14]。本研究中，雌激素可能通過(guò)MISS途徑與核受體ERα的膜性成分[10]、GPR30[15-16]等中的一種或幾種受體結(jié)合，快速激活第二信號(hào)系統(tǒng)，影響舌下神經(jīng)核放電。

肌電圖是將肌肉產(chǎn)生的動(dòng)作電位變化通過(guò)生物記錄系統(tǒng)處理后形成波形圖，反應(yīng)骨骼肌的活性。電刺激頦舌肌，產(chǎn)生的動(dòng)作電位幅值與肌肉內(nèi)神經(jīng)核纖維數(shù)有關(guān)。結(jié)果顯示，各組頦舌肌的動(dòng)作電位幅值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明選擇的SD大鼠頦舌肌的神經(jīng)肌肉狀況一致，排除了頦舌肌本身功能異常對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響的可能。肌電平均頻率、最大頻率、積分幅度、最大幅度能有效反映頦舌肌活性特征。結(jié)果顯示，隨著SD大鼠顱內(nèi)雌激素水平上升，舌下神經(jīng)核電生理活動(dòng)增強(qiáng)，反映頦舌肌肌電指標(biāo)數(shù)值增大（表2，圖3），提示雌激素可以通過(guò)改變舌下神經(jīng)核電生理特性進(jìn)而影響頦舌肌肌電特征。Popovic[17]等研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前頦舌肌肌電活動(dòng)明顯高于絕經(jīng)后，對(duì)絕經(jīng)后女性進(jìn)行雌激素替代治療，其頦舌肌電活性得到明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雌激素可通過(guò)中樞途徑—舌下神經(jīng)核影響頦舌肌功能，但雌激素引起舌下神經(jīng)核電生理學(xué)改變的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-07-26

編輯/張惠娟