葛含天　王達(dá)飛

[摘要] 目的 分析小細(xì)胞肺癌（SCLC）者循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測的應(yīng)用價(jià)值情況。方法 便利選擇2013年12月—2016年12月寶應(yīng)縣人民醫(yī)院收治的288例SCLC者為研究對象，另取健康體檢者70名，良性疾病組56例為對照者。使用免疫磁珠陰性富集和免疫熒光化學(xué)染色法，分析靜脈血內(nèi)CD45-/CTC/CK18+數(shù)量，隨訪104例化療者，分析SCLC者CTC檢測價(jià)值。結(jié)果 和良性疾病者（3.57%）以及對照組（5.71%）相比，SCLC組（64.58%）的CTC檢查結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對照組中CTC陽性率為5.7%，SCLC者臨床分期IIIA，IIIB和IV期陽性率分別為32.1%，56.9%以及78.1%。組間數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)單變量分析證實(shí)，腫瘤T和N分期與CTC陽性無相關(guān)性，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與其結(jié)果呈正相關(guān)（P<0.05）。陰性富集腫瘤回收率為92.0%，陽性對照細(xì)胞株H460和A549經(jīng)熒光抗體染色后上述兩種細(xì)胞株中存在細(xì)胞角蛋白CK18以及CK19。肺癌者敏感性以及特異性為98.2%以及72.9%。調(diào)查區(qū)間內(nèi)生存者共計(jì)248例CTC數(shù)量為2～4個(gè)，無顯著上升，其臨床特征為CTC陽性全身多發(fā)性轉(zhuǎn)移，PS分?jǐn)?shù)低。結(jié)論 該實(shí)驗(yàn)所使用的檢測方式簡便可行，特異性和敏感性較高，CTC陽性和疾病分期，是否吸煙，治療效果和轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)相關(guān)性，CTC越高，證實(shí)患者預(yù)后不良

[關(guān)鍵詞] CTC；角蛋白18相關(guān)抗原；免疫磁珠

[中圖分類號(hào)] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）08（a）-0046-03

[Abstracts] Objective This paper tries to analyze the application value of circulating tumor cells（CTC） inspection on small cell lung cancer（SCLC）. Methods 288 cases of SCLC from December 2013 to December 2016 in Baoying People's hospital were selected， 70 cases of healthy physical examination， 56 cases of benign disease as the control group. the number of venous CD45-/CTC/CK18+， CTC detection value of SCLC among the follow-up of 104 cases of chemotherapy were analyzed through negative immune magnetic beads enrichment and immunofluorescence chemical dyeing method. Results CTC test results of benign disease was 3.57% and that of the control group was 5.71%， SCLC group was 64.58%， and there were statistical differences（P<0.05）. CTC positive rate was 5.7% in control group， positive rate of the clinical stage IIIA， stage IIIB and IV of the SCLC group were 32.1%， 56.9% and 78.1%. There was difference between the groups （P<0.05）. Confirmed by univariate analysis， there was no correlation between the tumor T and N stage and CTC positive， and there was positively correlation between distant metastasis and its results（P<0.05）. Negative enrichment tumor recovery was 92.0%， the positive control cell line A549 and H460 by fluorescent antibody staining of the above two kinds of cell lines existed cytokeratin CK18 and CK19. Sensitivity and specificity of lung cancer was 98.2% and 72.9% respectively. Among the 248 cases of survivals CTC number were 2 to 4， with no significant increase， and with the clinical features of multiple transfers of CTC positive， and low PS score. Conclusion Inspection method in this study is simple and feasible， high specificity and sensitivity. There is correlation between the CTC positive and disease staging， smoking， treatment effect and transfers， the higher the CTC is， the poor condition of the patients have.endprint

[Key words] CTC； Keratin 18 related antigen； Immunemagnetic beads

現(xiàn)如今，我國的肺癌發(fā)生率已經(jīng)躍居世界之首[1-2]。當(dāng)癌細(xì)胞進(jìn)入到血液循環(huán)之后，一般經(jīng)過免疫系統(tǒng)以及血液流動(dòng)學(xué)轉(zhuǎn)移，極少數(shù)腫瘤細(xì)胞會(huì)隨著血液的流動(dòng)而形成轉(zhuǎn)移病灶。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）在機(jī)體內(nèi)水平代表了癌細(xì)胞血性轉(zhuǎn)移水平，CTC在檢測SCLC疾病的在早期診斷，監(jiān)控復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及判斷預(yù)后結(jié)果等方面，均具有一定臨床意義。結(jié)合實(shí)際情況，該文便利選擇2013年12月—2016年12月該院收治的288例SCLC者為研究對象，并設(shè)立對照組以及良性肺部疾病組，全面分析該疾病患者的CTC檢測應(yīng)用價(jià)值情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該文便利選擇該院收治的288例SCLC者為研究對象，另取健康體檢者70名，良性疾病組56例為對照者。

1.2 方法

①樣本收集：使用真空采血管，收集病患肘部正中靜脈血。為避免靜脈穿刺過程內(nèi)發(fā)生上皮細(xì)胞污染，不收集前2 mL血。收集后7.5 mL血液，后分別放置在ACD抗凝管內(nèi)。②磁珠富集：將收集好的血液在48 h內(nèi)完成CD45磁珠富集環(huán)節(jié)。③細(xì)胞固定：將通過以上步驟取得的細(xì)胞沉淀物質(zhì)，放在立離心管管底，加入劑量為40 μL的ASI液懸浮細(xì)胞沉淀，吹打沉淀。后將混合好的細(xì)胞液加入完成包被的Cytospin玻片中央加樣區(qū)，在室溫環(huán)境下靜止1～2 h，等到玻片干燥之后，實(shí)施染色，并將其放置在-80℃環(huán)境下保存。④細(xì)胞的化學(xué)染色，固定和顯色：在暗室內(nèi)，于玻片中滴入CD45抗體以及抗CK8，CK19以及CK19抗體以及0.2%BSA熒光體，靜置1.5 h，后分別對TBS以及20%的BSA清洗3次，完成后，于細(xì)胞區(qū)域內(nèi)加入內(nèi)含DAPI熒光計(jì)數(shù)液7 μL，加蓋玻片固定封存。完成所有步驟以后，可以在4℃環(huán)境下存儲(chǔ)或立即使用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。⑤PanCK染色：完成固定封片后，加PanCK染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

該實(shí)驗(yàn)使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，使用χ2計(jì)算，使用Spearmans相關(guān)性并分析法，進(jìn)行相關(guān)性分析，多變量分析使用Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者基線資料情況

該實(shí)驗(yàn)一共納入SCLC者288例。經(jīng)比較分析，和良性疾病者（3.57%）以及對照組（5.71%）相比，SCLC組（64.58%）的CTC檢查結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳細(xì)見表1。

2.2 健康者以及良性病變者、SCLC者CTC檢查結(jié)果情況

對照組中CTC陽性率為5.7%，2例CTC陽性者數(shù)值在2～2 631個(gè)，中位值11個(gè)，男性以及女性陽性率為65.2%以及64.3%。CTC未吸煙者占46.0%，吸煙史/正在吸煙者79.5%，組間數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。臨床分期IIIA，IIIB和IV期陽性率分別為32.1%，56.9%以及78.1%。組間數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)單變量分析證實(shí)，腫瘤T和N分期與CTC陽性無相關(guān)性，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與其結(jié)果呈正相關(guān)（P<0.05）。

2.3 細(xì)胞富集染色情況

陰性富集腫瘤回收率為92.0%，陽性對照細(xì)胞株H460和A549經(jīng)熒光抗體染色后，存在綠色和紅色熒光分布，疊加后為同一細(xì)胞，證實(shí)上述2種細(xì)胞株中存在細(xì)胞角蛋白CK18以及CK19。肺癌者敏感性以及特異性為98.2%以及72.9%。

2.4 SCLC者治療前后CTC分布情況

該實(shí)驗(yàn)對104例患者完成隨訪，結(jié)果詳見表2、及表3。

2.5 患者長期預(yù)后相關(guān)性情況

在288例SCLC者中，死亡40例。與采樣時(shí)間點(diǎn)相隔時(shí)間為0.5～3.7個(gè)月，中位數(shù)為1.2個(gè)月。該部分患者中，CTC數(shù)量為2～4個(gè)，無顯著上升，其臨床特征為CTC陽性全身多發(fā)性轉(zhuǎn)移，PS分?jǐn)?shù)低，證實(shí)CTC不可視為SCLC的預(yù)后指標(biāo)，應(yīng)聯(lián)合患者的其他臨床特征展開檢測。

3 討論

3.1 SCLC者臨床分級(jí)和CTC相關(guān)性分析

該實(shí)驗(yàn)指出，經(jīng)單變量分析證實(shí)，腫瘤T和N分期與CTC陽性無相關(guān)性，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與其結(jié)果呈正相關(guān)（P<0.05）。有文獻(xiàn)指出[3]，循環(huán)細(xì)胞檢出率和臨床分期不存在相關(guān)性，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能和納入樣本量、不同檢查方式等存在差異有關(guān)。

3.2 檢測方式尚具有提升空間

該文使用了CK蛋白對癌癥者CTC進(jìn)行標(biāo)記，特異性為72.9%，CK18、CK19是上皮細(xì)胞高表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白，其在SCLC者中表達(dá)量高。但這種測試方式陽性率較低。CK家族在標(biāo)記脫落細(xì)胞能力弱。出現(xiàn)這種情況的原因可能和癌細(xì)胞逃逸過程中出現(xiàn)“白細(xì)胞化”存在相關(guān)性。由于癌細(xì)胞在脫落、轉(zhuǎn)移以及定植過程中，會(huì)發(fā)生類似白細(xì)胞Rolling以及爬移形式，在此同時(shí)會(huì)伴隨細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，引起CK水平降低[4-5]。

3.3 化療與CTC之間的關(guān)聯(lián)性

該次結(jié)果實(shí)驗(yàn)指出，患者CTC數(shù)量在化療前后存在明顯差異。雖說完成治療后，部分患者依舊有少量的CTC，但與治療前相比（P<0.05）。該次實(shí)驗(yàn)中，有12例病患的CTC指標(biāo)治療后較治療前高，6例不久后疾病惡化，另外6例穩(wěn)定，在SD者中，2例曾為CR，后轉(zhuǎn)為陽性。有文獻(xiàn)證實(shí)[6]，腫瘤規(guī)格和CTC數(shù)量存在相關(guān)性?；蛘弋?dāng)癌瘤體積縮小后，癌組織以及會(huì)對微血管造成侵蝕。癌細(xì)胞就此落入血液循環(huán)，產(chǎn)生微轉(zhuǎn)移?；诋?dāng)前對于癌細(xì)胞參加血液循環(huán)時(shí)間規(guī)律以及CTC衰變周期尚無準(zhǔn)確定義，因此在實(shí)際工作中應(yīng)當(dāng)多點(diǎn)，多次檢測CTC更為合理[7]。

當(dāng)前，諸多學(xué)者對于CTC和預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行研究，認(rèn)為在治療前和治療后初次復(fù)診時(shí)CTC多少在和預(yù)后情況存在相關(guān)性[8]。該實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間跨度短，病例數(shù)不多，因此關(guān)于SCLC者循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步商榷。

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（收稿日期：2017-05-06）endprint