劉文霞, 朱益雷, 魏惠珍, , 呂 尚, 吳柳瑾,羅小妹, 饒 毅*, 方海紅*,3

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330006；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程中心，江西南昌 330006;3.江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330013)

表阿霉素(Epirubicin)是臨床上重要的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物[1]，已廣泛用于多種腫瘤的治療[2 - 6]。其相關(guān)的雜質(zhì)主要有阿霉素酮(Doxorubicinone)、柔紅霉酮(Daunorubicinone)、阿霉素(Doxorubicin)、雙氫柔紅霉素(Dihydrodaunorubicin)、柔紅霉素(Daunorubicin)和表柔紅霉素(Epi-daunorubicin)等。表阿霉素與其相關(guān)物質(zhì)在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上具有很高的相似度[7]。目前表阿霉素的測定方法主要有電致化學(xué)發(fā)光法[8]和液相色譜法。液相色譜法是分析表阿霉素較為理想的方法，但已報(bào)道方法[9 - 11 ]都是測定表阿霉素及其常見3種雜質(zhì)，而另外3種相關(guān)物質(zhì)研究較少。

反相液相色譜(RPLC)已經(jīng)成為現(xiàn)代色譜學(xué)一種廣泛使用的分離方法，然而在分析一些極性較大的化合物時(shí)，單一的反相色譜體系并不能得到滿意的分離效果，往往會(huì)出現(xiàn)保留不足或色譜峰拖尾的現(xiàn)象[12 - 13]。十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子表面活性劑，液相色譜法常常將其加入到流動(dòng)相中作為離子對試劑。樣品在流動(dòng)相中與離子對試劑生成不帶電荷的疏水性離子對[14]，然后吸附或溶解在固定相上。離子對試劑的烷基鏈越長，生成的離子對和反相鍵和相的親和力越強(qiáng)，組分的保留值越大。本實(shí)驗(yàn)將SDS作為高效液相色譜流動(dòng)相添加劑，考察不同條件對表阿霉素及其6種相關(guān)物質(zhì)色譜行為的影響，根據(jù)所得的色譜參數(shù)，進(jìn)一步了解其分離機(jī)理，為表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)的分離測定提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC20ADXR高效液相色譜儀(日本，島津公司)，配有二元梯度系統(tǒng)泵、在線脫氣系統(tǒng)、SPD檢測器；AUW2200 型十萬分之一電子分析天平(日本，島津公司)；AB104-N 型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；PB-10 型 pH 計(jì)(sartorius 公司)；Milli-Q 超純水儀(Milipore 公司)；KQ3200 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

表阿霉素、阿霉素酮、柔紅霉酮、阿霉素、雙氫柔紅霉素、柔紅霉素、表柔紅霉素對照品及表阿霉素原料藥均購自于意大利Sicor Società Italiana Corticosteroidi S.r.l公司。甲醇、乙腈(色譜純，TEDIA公司)；H3PO4、KH2PO4(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(優(yōu)級(jí)純，Sigma公司)；電阻率18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 對照品溶液的配制

取適量表阿霉素及其6種相關(guān)物質(zhì)對照品，用甲醇超聲溶解，配制成一定濃度的儲(chǔ)備液，臨用時(shí)用甲醇稀釋并按一定比例混合。

1.3 色譜條件

色譜柱：依利特 Hypersil ODS2柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相流速為1 mL/min，紫外檢測波長為253 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL。

離子對試劑濃度和pH指的是流動(dòng)相中水相部分，流動(dòng)相比例通過動(dòng)態(tài)混合二元泵調(diào)節(jié)，容量因子(k):k=(t-t0)/t0,其中t0為死時(shí)間，t為溶質(zhì)保留時(shí)間。t0測定方法：用100%乙腈進(jìn)樣1 μL甲醇所得保留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)測得該色譜柱死時(shí)間為2.130 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)相性質(zhì)的考察

本文首先考察甲醇和乙腈對表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)保留行為的影響。甲醇為典型的質(zhì)子化溶劑，容易形成氫鍵，可與水分子競爭固定相表面的活性位點(diǎn)，破壞富水層的形成，增加固定相表面的疏水性，從而導(dǎo)致組分難以洗脫下來[12]。將甲醇比例增大同樣會(huì)使組分間選擇性降低，難以分離開。而作為非質(zhì)子溶劑的乙腈洗脫能力更強(qiáng)，分離效果明顯優(yōu)于甲醇。

2.2 有機(jī)相比例的考察

分別調(diào)節(jié)流動(dòng)相中乙腈體積百分比為30%、42%、45%、47%、50%、55%，考察有機(jī)相百分?jǐn)?shù)與組分保留的影響。結(jié)果顯示，隨著乙腈比例增大，組分保留時(shí)間減小，當(dāng)乙腈比例為 30% 時(shí)，只有阿霉素酮及柔紅霉酮在60 min內(nèi)被洗脫下來，乙腈比例大于47% 時(shí)，阿霉素酮保留時(shí)間過短，會(huì)受溶劑峰干擾。因此離子對試劑濃度和pH均采用 42% 乙腈比例進(jìn)行考察。

2.3 離子對試劑濃度考察

按上述色譜條件，分別配制不同濃度(3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mmol/L)的SDS溶液，用H3PO4調(diào)節(jié)pH=3.0的緩沖液作為流動(dòng)相的水相部分，考察SDS濃度對表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)色譜行為的影響，SDS濃度與表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)的色譜參數(shù)(分離度、容量因子、理論塔板數(shù))變化見圖1(A～C)。

圖1 SDS濃度對分離度(A)、容量因子(B)、理論塔板數(shù)(C)的影響Fig.1 Effect of SDS concentration on the resolution(A)，capacity factor(B)and theoretical plate(C)Subscripts 1,2,3,4,5,6,7 of resolution(R),capacity factor(k),theoretical plate(N) refer to doxorubicinone,daunorubicinone,doxorubicin,epirubicin,dihydrodaunorubicin,daunorubicin,epi-daunorubicin .

由圖1可以看出，隨著離子對試劑(SDS)濃度增加，表阿霉素與相關(guān)物質(zhì)的容量因子增大(由于阿霉素酮及柔紅霉酮不含與離子對作用的極性基團(tuán)，保留值幾乎不受離子對試劑的影響)，理論塔板數(shù)有所下降，這主要是因?yàn)榱鲃?dòng)相中離子對試劑濃度增加，形成中性離子對復(fù)合物的能力加強(qiáng)，減弱了固定相上離子化組分與極性基團(tuán)之間的排斥作用，增強(qiáng)分析物在色譜柱上的保留。然而濃度較高的離子對試劑會(huì)影響反向C18色譜柱的活性位點(diǎn)，使柱效降低，因此為防止離子對試劑與固定相產(chǎn)生不可逆吸附，不宜使用過高濃度該試劑，并且實(shí)驗(yàn)后用大量水將其沖洗干凈，否則會(huì)大大縮短色譜柱的壽命。此外，各組分之間的選擇性隨著離子對試劑濃度增加而增大。

2.4 pH的考察

圖2 pH對容量因子(A)、對稱因子(B)、理論塔板數(shù)(C)的影響Fig.2 Effect of pH on the capacity factor(A)，asymmetry factor(B)and theoretical plate(C)Subscripts 1,2,3,4,5,6,7 of capacity factor(k),asymmetry factor(A),theoretical plate(N) refer to doxorubicinone,daunorubicinone,doxorubicin,epirubicin,dihydrodaunorubicin,daunorubicin,epi-daunorubicin.

圖3 表阿霉素原料藥在C18色譜柱上的分離譜圖Fig.3 Chromatogram of epirubicin raw materials on a C18 column

其他液相色譜條件相同情況下，考察流動(dòng)相中水相的不同pH值(2.3、3.0、4.2、5.8 )時(shí)表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)的容量因子、對稱因子與理論塔板數(shù)的變化，結(jié)果見圖2(A～C)。結(jié)果顯示，表阿霉素和阿霉素、雙氫柔紅霉素、柔紅霉素、表柔紅霉素保留值的變化受pH值基本一致，當(dāng)pH=2.3～4.2時(shí)，容量因子的變化趨于平坦，當(dāng) pH繼續(xù)增大，容量因子迅速上升，表明這5種成分存在離子交換作用，在酸性較強(qiáng)的情況下，組分主要以陽離子形式存在，隨著流動(dòng)相pH升高，組分由離子狀態(tài)漸漸轉(zhuǎn)化為分子狀態(tài)，在固定相的吸附能力逐漸增強(qiáng)，保留值增大。此外，對稱因子隨著緩沖液pH升高而增大，可能是酸性條件下流動(dòng)相對固定相上游離的硅羥基掩蔽作用導(dǎo)致[15]，從而減弱了分析物中極性基團(tuán)與硅羥基的作用[16]。與此同時(shí)，柱效隨著pH的升高而降低，這與離子交換作用能力強(qiáng)弱有關(guān)[17]，隨著緩沖液pH值增加，各組分的離子濃度降低，理論塔板數(shù)降低。阿霉素酮及柔紅霉酮由于分子結(jié)構(gòu)中缺少其他5種化合物上糖片段上-NH2，pH的變化對其影響很小，幾乎不存在離子交換作用。

2.5 實(shí)際樣品中的應(yīng)用

本文選擇表阿霉素原料藥作為研究對象，用于考察反相離子對色譜模型中實(shí)際樣品中表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)的分離效果。圖3所示為表阿霉素原料藥在C18柱的色譜分離圖，雜質(zhì)阿霉素酮、阿霉素與表阿霉素的分離度均大于2。在本實(shí)驗(yàn)條件下，表阿霉素與其異構(gòu)體阿霉素、雜質(zhì)得到了較好的分離，可用于表阿霉素的質(zhì)量控制。

3 結(jié)論

本文嘗試了在反相離子對色譜模型中，以SDS-磷酸鹽緩沖溶液和乙腈體系為流動(dòng)相，考察了表阿霉素及其6種相關(guān)物質(zhì)在C18柱中的色譜行為，主要探討緩沖液pH和離子對試劑SDS對分析物分離效果、保留因子和柱效的影響，證實(shí)了SDS可作為表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)高效液相色譜法的流動(dòng)相改性劑，根據(jù)分離物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，選擇不同的色譜條件，為該類化合物的分離測定方法提供新的思路。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，高濃度離子對試劑會(huì)降低色譜柱的柱效，溶解性較差的長烷基鏈離子對試劑對不同分析柱和整個(gè)色譜系統(tǒng)有所損傷等問題，有待進(jìn)一步深入研究。