葉 倩, 黃健祥， 駱 沖, 路大海, 鄧義才, 孫 玲*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心,廣東廣州 510640；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東廣州 510640；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510640)

植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有增強(qiáng)作物抗逆性、改善品質(zhì)、增加產(chǎn)量等作用[1]。矮壯素和丙環(huán)唑作為植物生長調(diào)節(jié)劑，近年來被用于控制菜心等葉菜的外形，促進(jìn)莖葉粗壯和葉色深綠，增加產(chǎn)量和提高品質(zhì)。目前我國尚未對矮壯素或丙環(huán)唑在葉菜中殘留限量做出規(guī)定，也無葉菜中其殘留測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，探討并建立檢測葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留標(biāo)準(zhǔn)具有實(shí)際意義。日本肯定列表規(guī)定，矮壯素和丙環(huán)唑在菜心、芥藍(lán)和小白菜中的限量均為0.05 mg/kg[2]。矮壯素的檢測方法目前主要采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[3 - 4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[5 - 12]。這些分析方法的應(yīng)用范圍包括蔬菜、水果、果汁、土壤、谷物及小鼠肌肉等樣品。采用的樣品處理方法常為有機(jī)溶劑提取結(jié)合陽離子交換柱凈化，但存在操作繁瑣、消耗時(shí)間長等不足。近年來，丙環(huán)唑的分析研究報(bào)道中，越來越多采用LC-MS/MS法[13 - 19]，應(yīng)用于蔬菜、水果、土壤、水、酒及嬰兒食品等樣品。葉菜的基質(zhì)成分復(fù)雜，分離分析難度大，檢測干擾嚴(yán)重。葉菜中矮狀素和丙環(huán)唑同時(shí)測定的方法尚未見于報(bào)道。

QuEChERS技術(shù)具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于農(nóng)藥殘留分析的前處理過程中。LC-MS/MS具有高通量、高選擇性和高靈敏度等特點(diǎn)，是農(nóng)藥殘留分析的熱點(diǎn)技術(shù)之一。本文以芥藍(lán)、菜心、小白菜為研究對象，優(yōu)化了QuEChERS前處理?xiàng)l件、色譜條件和質(zhì)譜條件等，建立了基于LC-MS/MS法的葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留的分析方法。并利用該方法分析了市場上流通的葉菜樣品。該方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，滿足葉菜中農(nóng)藥殘留分析的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LCMS-8050三重四極桿質(zhì)譜，配島津LC-30AD超高效液相色譜(日本，Shimadzu公司)，電噴霧離子源(ESI)；VX-200渦旋儀(美國，Labnet公司)；高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；Milli Q超純水系統(tǒng)(美國，Millipore)。

1 000 mg/L矮壯素、丙環(huán)唑溶液(純度≥99.0%，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心)，用乙腈配制成100 mg/L的儲備液，-20 ℃保存。使用不含待測化合物的菜心、芥藍(lán)、小白菜空白基質(zhì)將矮壯素配制成0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.00 mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；丙環(huán)唑配制成0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50 mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。乙腈和甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；C18、石墨化碳黑(GCB)、Florisil凈化劑(天津博納艾杰爾公司)；PSA凈化劑(美國Agilent公司)；HAc、無水HgSO4、無水NaAc均為分析純。尼龍66微孔過濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

芥藍(lán)、菜心和小白菜樣品購自本地市場。

1.2 樣品前處理

樣品去除枯黃葉片，組織經(jīng)勻漿機(jī)勻漿后，低溫保存?zhèn)溆?。稱取10.00 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL含1%HAc的乙腈溶液，加入4.00 g無水MgSO4和1.00 g無水NaAc，渦旋振蕩3 min，再以4 500 r/min 離心5 min。取5 mL上清液于10 mL離心管中(內(nèi)含75 mg PSA、425 mg無水MgSO4、50 mg C18)，渦旋混勻1 min后，以4 500 r/min離心5 min，取上清液以0.22 μm尼龍66濾膜過濾，待測定。

1.3 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱為島津Shim-pack XR-ODSⅢ柱(75×2.0 mm,1.6 μm)。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫程序：0.5～2 min,10%B；2～5 min,10%～95%B；5～7 min,95%B；7.1 min,10%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測。霧化氣流速：3 L/min；加熱氣流速：10 L/min；干燥氣流速：10 L/min；離子源接口溫度：300 ℃；脫溶劑溫度：250 ℃。矮壯素、丙環(huán)唑的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 矮壯素和丙環(huán)唑質(zhì)譜檢測參數(shù)

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

矮壯素、丙環(huán)唑在進(jìn)入一級質(zhì)譜后，可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+離子，該離子即為兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的母離子。在Product Scan模式下，對化合物母離子施加一定的碰撞能(CE)，母離子發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的離子碎片，進(jìn)入二級質(zhì)譜。最后在MRM模式下，優(yōu)化Q1、Q3電壓及目標(biāo)物離子碎片的碰撞能量。兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的二級離子質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 矮壯素(A)和丙環(huán)唑(B)的二級離子質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectra of chlormequat (A) and propiconazole (B)

2.2 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)了SHIMADZU-GL Inertsil HILIC(150×2.1 mm,3 μm)、Phenomenex HILIC柱(100×2.1 mm,2.6 μm)和Shim-pack XR-ODS Ⅲ柱(75×2.0 mm,1.6 μm)3種色譜柱對待測物的分離效果。結(jié)果表明矮壯素和丙環(huán)唑在SHIMADZU-GL HILIC柱和Phenomenex HILIC柱兩種色譜柱上的分離重現(xiàn)性以及峰形較差。矮壯素為強(qiáng)極性化合物，在Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱上保留時(shí)間小于1 min。多次實(shí)驗(yàn)表明，矮壯素和丙環(huán)唑在該柱的分離重現(xiàn)性以及峰形都達(dá)到檢測所需的要求，因此選取Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱。

實(shí)驗(yàn)對比了有機(jī)相：乙腈/甲醇與水相：0.1%甲酸溶液/0.3%甲酸溶液/20 mmol/L NH4Ac溶液六種組合，考察其對目標(biāo)物的分離效果及靈敏度的影響。結(jié)果表明：有機(jī)相為乙腈，水相為0.1%甲酸溶液時(shí)待測物的分離效果和靈敏度都比較好。

2.3 提取溶劑的選擇

根據(jù)矮壯素和丙環(huán)唑的性質(zhì)，以不含待測化合物的菜心為基質(zhì)，對比了乙腈、含1%HAc的乙腈和含1%HAc+49%水的乙腈溶液的提取效果。如圖2所示，使用含1%HAc的乙腈溶液為提取溶劑時(shí)，矮壯素和丙環(huán)唑的回收率均可達(dá)到80%，滿足農(nóng)藥定量分析要求[20]。實(shí)驗(yàn)采用含1%HAc的乙腈溶液為提取溶劑。

2.4 吸附劑的優(yōu)化

以不含待測化合物的菜心為基質(zhì)，對比了PSA、C18、GCB、Florisil和無水MgSO4+PSA+C18的凈化效果。如圖3所示，使用無水MgSO4+PSA+C18混合吸附劑時(shí)矮壯素和丙環(huán)唑的回收率都達(dá)到80%以上，滿足農(nóng)藥定量分析要求[20]。最終采用無水MgSO4+PSA+C18混合吸附劑對樣品進(jìn)行凈化處理。

圖2 提取溶劑對矮壯素和丙環(huán)唑回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on recoveries of chlormequat and propiconazole

圖3 吸附劑對矮壯素和丙環(huán)唑回收率的影響Fig.3 Effect of adsorbents on recoveries of chlormequat and propiconazole

2.5 線性方程、檢出限和定量限

采用1.2節(jié)的方法對不含待測化合物的菜心、芥藍(lán)、小白菜進(jìn)行前處理，得到三種空白基質(zhì)以配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。以待測物濃度為橫坐標(biāo)(x)，定量離子對的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)獲得矮壯素和丙環(huán)唑的工作曲線。兩種化合物的線性方程、檢出限(信噪比S/N=3)(LOD)和定量限(LOQ)見表2，矮壯素和丙環(huán)唑的定量限LOQ為添加的最低濃度0.010 mg/kg，滿足菜心、芥藍(lán)、小白菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留安全檢測的要求[2]。

表2 矮壯素、丙環(huán)唑的線性方程、檢出限和定量限

2.6 方法回收率和精密度

稱取經(jīng)測定不含矮壯素和丙環(huán)唑的空白樣品10.00 g，分別對應(yīng)添加0.010、0.10和0.50 mg/kg 3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。渦旋混勻后放置過夜12 h，按照1.2節(jié)進(jìn)行前處理。每個(gè)添加濃度水平重復(fù)3次測定，考察方法回收率和精密度，結(jié)果見表3。方法準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析要求。菜心中矮壯素和丙環(huán)唑的色譜圖如圖4所示。

表3 矮壯素、丙環(huán)唑在葉菜中的添加回收率(n=3)

圖4 加標(biāo)菜心樣品中矮壯素(1)和丙環(huán)唑(2)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.4 Liquid chromatography-tandem mass spectrometric chromatograms of chlormequat(1) and propiconazole(2) in spiked flowering Chinese cabbage samples(a) blank extract；(b) standard solution of 10 μg/L；(c) sample spiked with 10 μg/kg.

采用本方法分析了市面上銷售的芥藍(lán)、菜心和小白菜各5個(gè)樣品共15例。所有樣品均未檢出矮壯素；1個(gè)芥藍(lán)和1個(gè)菜心樣品中檢出有丙環(huán)唑，檢出值分別為2 μg/kg和4 μg/kg,低于定量限。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS快速測定3種葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑的分析方法。對比現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 20769-2008)中的樣品前處理方法，本文中所用的QuEChERS法操作簡單、步驟少、時(shí)間消耗低，能有效去除蔬菜基質(zhì)干擾；方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度等滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求，適用于葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留的快速同時(shí)分析。