葉 倩, 黃健祥， 駱 沖, 路大海, 鄧義才, 孫 玲*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心,廣東廣州 510640；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(廣州),廣東廣州 510640；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室,廣東廣州 510640)

植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有增強作物抗逆性、改善品質(zhì)、增加產(chǎn)量等作用[1]。矮壯素和丙環(huán)唑作為植物生長調(diào)節(jié)劑，近年來被用于控制菜心等葉菜的外形，促進莖葉粗壯和葉色深綠，增加產(chǎn)量和提高品質(zhì)。目前我國尚未對矮壯素或丙環(huán)唑在葉菜中殘留限量做出規(guī)定，也無葉菜中其殘留測定的標準方法。因此，探討并建立檢測葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留標準具有實際意義。日本肯定列表規(guī)定，矮壯素和丙環(huán)唑在菜心、芥藍和小白菜中的限量均為0.05 mg/kg[2]。矮壯素的檢測方法目前主要采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[3 - 4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[5 - 12]。這些分析方法的應用范圍包括蔬菜、水果、果汁、土壤、谷物及小鼠肌肉等樣品。采用的樣品處理方法常為有機溶劑提取結(jié)合陽離子交換柱凈化，但存在操作繁瑣、消耗時間長等不足。近年來，丙環(huán)唑的分析研究報道中，越來越多采用LC-MS/MS法[13 - 19]，應用于蔬菜、水果、土壤、水、酒及嬰兒食品等樣品。葉菜的基質(zhì)成分復雜，分離分析難度大，檢測干擾嚴重。葉菜中矮狀素和丙環(huán)唑同時測定的方法尚未見于報道。

QuEChERS技術具有快速、高效等優(yōu)點，被廣泛運用于農(nóng)藥殘留分析的前處理過程中。LC-MS/MS具有高通量、高選擇性和高靈敏度等特點，是農(nóng)藥殘留分析的熱點技術之一。本文以芥藍、菜心、小白菜為研究對象，優(yōu)化了QuEChERS前處理條件、色譜條件和質(zhì)譜條件等，建立了基于LC-MS/MS法的葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留的分析方法。并利用該方法分析了市場上流通的葉菜樣品。該方法具有快速、簡便、準確等特點，滿足葉菜中農(nóng)藥殘留分析的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LCMS-8050三重四極桿質(zhì)譜，配島津LC-30AD超高效液相色譜(日本，Shimadzu公司)，電噴霧離子源(ESI)；VX-200渦旋儀(美國，Labnet公司)；高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；Milli Q超純水系統(tǒng)(美國，Millipore)。

1 000 mg/L矮壯素、丙環(huán)唑溶液(純度≥99.0%，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心)，用乙腈配制成100 mg/L的儲備液，-20 ℃保存。使用不含待測化合物的菜心、芥藍、小白菜空白基質(zhì)將矮壯素配制成0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.00 mg/L系列基質(zhì)標準溶液；丙環(huán)唑配制成0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50 mg/L系列基質(zhì)標準溶液。乙腈和甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；C18、石墨化碳黑(GCB)、Florisil凈化劑(天津博納艾杰爾公司)；PSA凈化劑(美國Agilent公司)；HAc、無水HgSO4、無水NaAc均為分析純。尼龍66微孔過濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)。

芥藍、菜心和小白菜樣品購自本地市場。

1.2 樣品前處理

樣品去除枯黃葉片，組織經(jīng)勻漿機勻漿后，低溫保存?zhèn)溆?。稱取10.00 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL含1%HAc的乙腈溶液，加入4.00 g無水MgSO4和1.00 g無水NaAc，渦旋振蕩3 min，再以4 500 r/min 離心5 min。取5 mL上清液于10 mL離心管中(內(nèi)含75 mg PSA、425 mg無水MgSO4、50 mg C18)，渦旋混勻1 min后，以4 500 r/min離心5 min，取上清液以0.22 μm尼龍66濾膜過濾，待測定。

1.3 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱為島津Shim-pack XR-ODSⅢ柱(75×2.0 mm,1.6 μm)。流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈。梯度洗脫程序：0.5～2 min,10%B；2～5 min,10%～95%B；5～7 min,95%B；7.1 min,10%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，正離子多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測。霧化氣流速：3 L/min；加熱氣流速：10 L/min；干燥氣流速：10 L/min；離子源接口溫度：300 ℃；脫溶劑溫度：250 ℃。矮壯素、丙環(huán)唑的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 矮壯素和丙環(huán)唑質(zhì)譜檢測參數(shù)

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

矮壯素、丙環(huán)唑在進入一級質(zhì)譜后，可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+離子，該離子即為兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的母離子。在Product Scan模式下，對化合物母離子施加一定的碰撞能(CE)，母離子發(fā)生斷裂或重排等反應產(chǎn)生不同的離子碎片，進入二級質(zhì)譜。最后在MRM模式下，優(yōu)化Q1、Q3電壓及目標物離子碎片的碰撞能量。兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的二級離子質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 矮壯素(A)和丙環(huán)唑(B)的二級離子質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectra of chlormequat (A) and propiconazole (B)

2.2 色譜條件優(yōu)化

實驗了SHIMADZU-GL Inertsil HILIC(150×2.1 mm,3 μm)、Phenomenex HILIC柱(100×2.1 mm,2.6 μm)和Shim-pack XR-ODS Ⅲ柱(75×2.0 mm,1.6 μm)3種色譜柱對待測物的分離效果。結(jié)果表明矮壯素和丙環(huán)唑在SHIMADZU-GL HILIC柱和Phenomenex HILIC柱兩種色譜柱上的分離重現(xiàn)性以及峰形較差。矮壯素為強極性化合物，在Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱上保留時間小于1 min。多次實驗表明，矮壯素和丙環(huán)唑在該柱的分離重現(xiàn)性以及峰形都達到檢測所需的要求，因此選取Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱。

實驗對比了有機相：乙腈/甲醇與水相：0.1%甲酸溶液/0.3%甲酸溶液/20 mmol/L NH4Ac溶液六種組合，考察其對目標物的分離效果及靈敏度的影響。結(jié)果表明：有機相為乙腈，水相為0.1%甲酸溶液時待測物的分離效果和靈敏度都比較好。

2.3 提取溶劑的選擇

根據(jù)矮壯素和丙環(huán)唑的性質(zhì)，以不含待測化合物的菜心為基質(zhì)，對比了乙腈、含1%HAc的乙腈和含1%HAc+49%水的乙腈溶液的提取效果。如圖2所示，使用含1%HAc的乙腈溶液為提取溶劑時，矮壯素和丙環(huán)唑的回收率均可達到80%，滿足農(nóng)藥定量分析要求[20]。實驗采用含1%HAc的乙腈溶液為提取溶劑。

2.4 吸附劑的優(yōu)化

以不含待測化合物的菜心為基質(zhì)，對比了PSA、C18、GCB、Florisil和無水MgSO4+PSA+C18的凈化效果。如圖3所示，使用無水MgSO4+PSA+C18混合吸附劑時矮壯素和丙環(huán)唑的回收率都達到80%以上，滿足農(nóng)藥定量分析要求[20]。最終采用無水MgSO4+PSA+C18混合吸附劑對樣品進行凈化處理。

圖2 提取溶劑對矮壯素和丙環(huán)唑回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on recoveries of chlormequat and propiconazole

圖3 吸附劑對矮壯素和丙環(huán)唑回收率的影響Fig.3 Effect of adsorbents on recoveries of chlormequat and propiconazole

2.5 線性方程、檢出限和定量限

采用1.2節(jié)的方法對不含待測化合物的菜心、芥藍、小白菜進行前處理，得到三種空白基質(zhì)以配制標準溶液。以待測物濃度為橫坐標(x)，定量離子對的色譜峰面積為縱坐標(y)獲得矮壯素和丙環(huán)唑的工作曲線。兩種化合物的線性方程、檢出限(信噪比S/N=3)(LOD)和定量限(LOQ)見表2，矮壯素和丙環(huán)唑的定量限LOQ為添加的最低濃度0.010 mg/kg，滿足菜心、芥藍、小白菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留安全檢測的要求[2]。

表2 矮壯素、丙環(huán)唑的線性方程、檢出限和定量限

2.6 方法回收率和精密度

稱取經(jīng)測定不含矮壯素和丙環(huán)唑的空白樣品10.00 g，分別對應添加0.010、0.10和0.50 mg/kg 3個濃度水平的混合標準溶液。渦旋混勻后放置過夜12 h，按照1.2節(jié)進行前處理。每個添加濃度水平重復3次測定，考察方法回收率和精密度，結(jié)果見表3。方法準確度和精密度均符合殘留分析要求。菜心中矮壯素和丙環(huán)唑的色譜圖如圖4所示。

表3 矮壯素、丙環(huán)唑在葉菜中的添加回收率(n=3)

圖4 加標菜心樣品中矮壯素(1)和丙環(huán)唑(2)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.4 Liquid chromatography-tandem mass spectrometric chromatograms of chlormequat(1) and propiconazole(2) in spiked flowering Chinese cabbage samples(a) blank extract；(b) standard solution of 10 μg/L；(c) sample spiked with 10 μg/kg.

采用本方法分析了市面上銷售的芥藍、菜心和小白菜各5個樣品共15例。所有樣品均未檢出矮壯素；1個芥藍和1個菜心樣品中檢出有丙環(huán)唑，檢出值分別為2 μg/kg和4 μg/kg,低于定量限。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS快速測定3種葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑的分析方法。對比現(xiàn)行的國家標準(GB/T 20769-2008)中的樣品前處理方法，本文中所用的QuEChERS法操作簡單、步驟少、時間消耗低，能有效去除蔬菜基質(zhì)干擾；方法的靈敏度、準確度和精密度等滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求，適用于葉菜中矮壯素和丙環(huán)唑殘留的快速同時分析。