李 斌， 黃玲玲， 徐小梅， 萬益群*，2

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031；2.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌 330047)

代謝組學(xué)是監(jiān)測生物體在病理生理狀態(tài)下內(nèi)源性代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的學(xué)科，常用于疾病的早期診斷、治療以及術(shù)后評(píng)估[1 - 3]，在疾病研究中受到廣泛的關(guān)注。代謝組學(xué)在惡性腫瘤研究中也顯示其獨(dú)特的優(yōu)勢[4 - 6]，特別是在腫瘤的早期診斷、病理分析以及預(yù)后評(píng)估方面發(fā)揮著重要的作用。目前，代謝組學(xué)研究技術(shù)主要有核磁共振波譜(NMR)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法(CE-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[7 - 8]。其中，氣相色譜-質(zhì)譜法由于具有較高的靈敏度、分離度以及較完整的質(zhì)譜庫而被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究當(dāng)中。同時(shí)，用于代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)處理方法也有多種[9]，包括主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)、層級(jí)聚類分析(HCA)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NN)和遺傳算法(GA)等[10 - 12]。

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病機(jī)理尚不清楚，環(huán)境的誘導(dǎo)和遺傳物質(zhì)的變異可能為其重要的致病因素。目前，臨床上乳腺癌診斷的主要方法包括X線射影、超聲掃描、MRI掃描、CT掃描的影像方法，以及借影像定位穿刺活檢明確診斷的方法。這些方法對(duì)中晚期乳腺癌的診斷有較好的準(zhǔn)確性，而對(duì)早期乳腺癌的診斷缺乏特異性和靈敏度。由于乳腺腫瘤標(biāo)志物可以反映腫瘤的生物學(xué)特性，對(duì)于臨床診斷和治療有較好的輔助作用，并對(duì)乳腺腫瘤的預(yù)后判斷具有重要的意義，所以腫瘤標(biāo)志物的篩選也越來越受到研究者的重視。采用代謝組學(xué)方法篩查用于乳腺癌早期診斷的特異性標(biāo)志物，并開發(fā)快速、無創(chuàng)傷的乳腺癌早期診斷新技術(shù)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[13 - 14]。本文以乳腺癌患者、一般疾病者和健康人血清為研究對(duì)象，采用氣相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)，構(gòu)建了其血清代謝指紋圖譜，并采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析，對(duì)乳腺癌標(biāo)志物的篩查進(jìn)行了初步的有益探索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6890N/5973I氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國，安捷倫公司)，包括Agilent 7683自動(dòng)進(jìn)樣器和氣相色譜-質(zhì)譜工作站(D.01.02)；KQ-100DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AP250D型電子天平(奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司)；TDL-5-A型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；MS2型迷你振蕩器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)。

N,O -雙甲氧基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)、甲氧胺鹽酸鹽(美國Sigma公司)；異亮氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、半胱氨酸、甘氨酸、色氨酸、谷氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸鹽、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、天門冬氨酸、天門冬酰胺、組氨酸、絲氨酸、4-羥基脯氨酸、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；半乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正二十二烷、吡啶、正庚烷(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-QS超純水裝置(美國，Millipore公司)制備。

1.2 氣相色譜分析條件

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；升溫程序：85 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至300 ℃保持10 min；載氣：高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL(不分流進(jìn)樣)；溶劑延遲5 min。

1.3 質(zhì)譜條件

GC-MS接口溫度：280 ℃；電離方式：EI，電離能量70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子倍增器電壓：1 753 V；采集方式：全掃描(m/z)60～600。

1.4 樣品采集及前處理

經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的乳腺癌患者30例；乳腺檢查無異常、無乳腺癌發(fā)病史的健康對(duì)照組32例；一般疾病者30例，三組樣本在年齡、性別方面都較匹配。采集各類人群(其中乳腺癌血清樣本為患者入院后未進(jìn)行任何治療)晨起靜脈血4 mL，4 000 r/min離心20 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?00 μL血清于1 mL的塑料離心管中，加入800 μL甲醇、乙腈和丙酮的混合溶液(甲醇∶乙腈∶丙酮=1∶1∶1(V/V))，渦旋1 min，冰浴超聲10 min，10 000 r/min 離心10 min。吸取上清液800 μL于進(jìn)樣瓶，氮?dú)獯蹈珊?，加?5 μL甲氧胺吡啶溶液，70 ℃反應(yīng)1 h后，冷卻至室溫。再加入BSTFA+1%TMCS溶液75 μL，室溫反應(yīng)1 h，加入150 μL終止溶劑正庚烷(含0.1 g/L二十二烷)，以二十二烷為代謝物定量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，待測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

人體血清成分主要以氨基酸、糖類和脂肪酸三類代謝物為主。為獲得血清中更多的代謝信息，實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈、丙酮對(duì)血清中內(nèi)源性物質(zhì)的提取效果。結(jié)果表明，甲醇和乙腈可沉淀蛋白，對(duì)血清中的氨基酸類物質(zhì)提取效果較好，而丙酮對(duì)血清中糖類和脂肪酸類物質(zhì)提取效果較好，但蛋白質(zhì)沉淀能力不強(qiáng)。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選用甲醇∶乙腈∶丙酮=1∶1∶1(V/V/V)作為血清內(nèi)源性物質(zhì)的提取劑和蛋白質(zhì)沉淀劑。采用BSTFA+1%TMCS溶液對(duì)提取液進(jìn)行衍生化，并在優(yōu)化的分析條件下進(jìn)行測定[15 - 18]。

圖1 乳腺癌血清樣本分析的色譜圖Fig.1 Chromatogram of serum samples from breast cancer

2.2 色譜分離條件的選擇

為了使血清中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)良好的分離，實(shí)驗(yàn)分別考察了下列四種升溫程序下組分的分離情況：(1) 85 ℃保持5 min，10 ℃/min升至300 ℃保持10 min；(2) 85 ℃保持5 min，以8 ℃/min升至205 ℃保持5 min，再以8 ℃/min升至300 ℃保持5 min；(3) 100 ℃保持3 min，以8 ℃/min升至300 ℃保持2 min；(4) 70 ℃保持5 min，以20 ℃/min升至160 ℃保持4 min，10 ℃/min升至300 ℃保持1.5 min。綜合考慮代謝物質(zhì)的分離效果和色譜峰個(gè)數(shù)，選擇第一種升溫程序作為實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)際血清樣品的色譜分離圖見圖1。

2.3 血清樣本分析

將采集到的血清樣本92例,其中健康人32例，一般疾病者30例，乳腺癌患者30例，按優(yōu)化的樣品前處理方法和氣相色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，共得到了30個(gè)共有峰。為了對(duì)血清中復(fù)雜的代謝物進(jìn)行定性，我們將其分為氨基酸、糖類和脂肪酸代謝產(chǎn)物三大類，其中脂肪酸類物質(zhì)的衍生物在NIST數(shù)據(jù)庫中信息豐富，且其匹配度>95%，可以直接從譜庫中定性；而氨基酸和糖類物質(zhì)經(jīng)過衍生化后在質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中匹配率較低，因此此兩類物質(zhì)采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性，實(shí)驗(yàn)以二十二烷為內(nèi)標(biāo)，定量結(jié)果以代謝物峰面積(Ax)與內(nèi)標(biāo)物峰面積(Ai)比值的形式表示，表1列出了30個(gè)共有峰的定性及定量結(jié)果。

表1 血清樣品中30個(gè)色譜共有峰的定性及定量結(jié)果

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

分別采用主成分分析(PCA)和隨機(jī)森林算法(RF)對(duì)三組樣本的氨基酸、糖類和脂肪酸代謝產(chǎn)物的分布、分類情況進(jìn)行分析。采用PCA對(duì)三類數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到的分析結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出健康人和一般疾病者的樣本點(diǎn)距離比較近，且存在部分重疊，而乳腺癌患者樣本點(diǎn)距離健康人和一般疾病者較遠(yuǎn)，表明乳腺癌對(duì)人體的代謝有較大影響。PCA分析能夠初步地體現(xiàn)樣本間的差異，進(jìn)一步采用隨機(jī)森林(RF)算法對(duì)這三類數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，見圖3。圖3表明，和PCA分析結(jié)果相比，隨機(jī)森林算法能夠更加有效地區(qū)分不同組群樣本間的差異，并在訓(xùn)練的過程中能夠得到各代謝物的變量重要度信息，而其中對(duì)分類起著重要作用的變量可能是潛在的生物標(biāo)志物。

從圖3可見，使用隨機(jī)森林算法得到的分類模型，不同組間的差異被更加明顯地反映出來，圖4中列出了各代謝產(chǎn)物的變量重要度。在乳腺癌樣品和非乳腺癌組樣品中具有顯著性差異的物質(zhì)主要有磷酸、2,4-二羥基丁酸、N-巴豆?；拾彼帷-1-己酰甘氨酸、N-苯基甘氨酸和棕櫚酸。蛋白質(zhì)的磷酸化過程是生物體代謝的重要調(diào)節(jié)過程，對(duì)正常的生物化學(xué)反應(yīng)有重要的指示作用，通過磷酸化和去磷酸過程細(xì)胞進(jìn)行正常的物質(zhì)代謝，磷酸含量出現(xiàn)顯著性差異說明乳腺癌可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的磷酸化過程發(fā)生異常。三種甘氨酸類似物表現(xiàn)出明顯的差異，說明甘氨酸的代謝途徑可能在乳腺癌患者中發(fā)生了改變，使其次級(jí)代謝途徑中的三種代謝物發(fā)生了變化。2,4-二羥基丁酸和棕櫚酸都屬于脂肪酸家族代謝物質(zhì)，脂質(zhì)代謝與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系早有報(bào)道，Lv等[19]采用氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)法分析了乳腺癌患者游離脂肪酸的代謝譜，通過游離脂肪酸代謝組學(xué)分析，將健康對(duì)照組和乳腺癌組完全分開，得到幾種差異明顯的代謝物，主要有棕櫚酸，亞油酸，硬脂酸等，有可能作為乳腺癌早期診斷的標(biāo)志物。本研究結(jié)果也說明了脂肪酸的代謝與乳腺癌的發(fā)生有一定的聯(lián)系，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。

圖2 三類樣本的主成分分析(PCA)結(jié)果Fig.2 Analytical results of three group of samples with PCA

圖3 三類樣本的隨機(jī)森林算法(RF)分析結(jié)果Fig.3 Analytical results of three group samples with RF

圖4 各代謝產(chǎn)物的變量重要度Fig.4 The variable importance of metabolites

3 結(jié)論

本文采用氣相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)乳腺癌患者血清中的代謝物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，通過主成分分析和隨機(jī)森林算法對(duì)健康組、一般疾病者組和乳腺癌患者組進(jìn)行了分類，篩選出具有顯著性差異的六種物質(zhì)：磷酸、2,4-二羥基丁酸、N-巴豆?；拾彼?、N-1-己酰甘氨酸、N-苯基甘氨酸和棕櫚酸。此六種物質(zhì)出現(xiàn)明顯差異，說明乳腺癌疾病導(dǎo)致脂質(zhì)和氨基酸代謝發(fā)生了異常。