丁 潔， 周 樂， 黃國良

(1.廣東醫(yī)科大學中美聯合腫瘤研究所，廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東東莞，523808;2.廣東醫(yī)科大學藥學院，廣東東莞 523808)

膠體介孔SiO2(CMS)作為一種優(yōu)良的無機納米藥物載體已被廣泛應用于生物醫(yī)學中，尤其適用于抗癌藥物的負載。CMS相較于其他的有機或高分子聚合物載體，獨特的物理化學穩(wěn)定性和一系列有利的結構特性使其具備了構建智能給藥系統(DDS)的能力[1 - 3]。具有中空和介孔結構的CMS可選擇性容納藥物分子[4 - 5]。另外，CMS還可以根據實際需求調整尺寸以便于其在癌細胞中的有效聚集，以及通過實體瘤的高通透性和滯留效應(EPR effect)在活體的腫瘤部位沉積[6 - 8]。將官能團修飾在CMS表面通常有后嫁接法和共縮合法兩種方法。與后嫁接法相比，共縮合法能根據投料時間和量的不同控制官能團修飾的位置。通過共縮合法可合成表面帶氨基的CMS，使其帶正電荷，用于負載帶負電荷的抗癌藥物[9]。

5F(Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid)是從粵產草藥半邊旗(PterissemipinnataL，PsL)中分離提取制備的一個活性化合物。研究發(fā)現，無論是活體實驗還是體外實驗，5F均可抑制結腸癌、肝癌及肺癌等多種腫瘤細胞的生長[10 - 13]。5F的抗腫瘤效果曾與一個著名的、在美國及日本正在進行臨床實驗的抗癌新藥7-羥基十字孢堿(7-hydroxystaurosporine，UCN-01)進行過比較[14 - 15]，UCN-01較其母體化合物十字孢堿在抑制蛋白激酶C活性方面更具特異性。結果證實，5F可通過與UCN-01類似的方式誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，且作用更強，30 nmol/L的5F即可達到100 nmol/L UCN-01對腫瘤細胞的抑制效果，兩者誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的水平相似，產生的時間過程曲線也相似[16]。但與其他抗癌藥物類似，5F也有半衰期，這大大縮短了其在活體內循環(huán)的時間，還未起到完全的治療作用即被代謝出體外[17 - 18]。

本文通過體外細胞實驗研究了5F抑制鼻咽癌細胞生長的情況，設計了增強5F藥效的藥物載體膠體介孔SiO2(CMS)，借助該載體穩(wěn)定了5F的分子結構，延長了5F的半衰期，提高了5F對腫瘤細胞的抑制效果。該設計具有普適性，在抗癌藥物攜帶和腫瘤治療方面具有廣闊的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CMS的形貌通過JEOL-2010透射電鏡(TEM)在加速電壓200 kV下獲得。Nanodrop-2000C紫外-可見分光光度計在242 nm處測量吸收強度換算5F的濃度。TCS SP5 共聚焦激光顯微鏡(Leica,Germany)進行共聚焦成像。全波長掃描式多功能讀數儀(Thermo Fisher Scientific，Varioskan Flash)讀取細胞經CCK-8孵育后的吸光度，計算細胞活性。

(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、三乙醇胺(TEA)、正硅酸乙酯(TEOS)、氯化十六烷基三甲基銨(CTAC)、苯基三乙氧基硅烷(PTES)，均購于Sigma-Aldrich。5F購于上海超研生物科技有限公司。1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco。丙烯酰胺、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫蘇糖醇(DDT)、甘氨酸(Gly)、HCl(36%)和溴酚藍(BPB)購自國藥集團化學試劑有限公司。CCK-8試劑盒購自東仁化學科技有限公司。Caspase-3試劑盒、CNE2細胞購自凱基生物技術股份有限公司。整個實驗中的用水都是超純水，所有的試劑都沒有經過進一步純化。

伊利奶粉購自超市。

1.2 多功能熒光核-殼介孔SiO2(CMS)的合成

FITC-APTES的合成：2 mg FITC溶于10 mL無水乙醇中，加入0.05 mL APTES，避光反應20 h，離心、棄去上清液，備用。溶液1：15 mL TEA與1.76 mL TEOS以及113 μL PTES混合加熱至90 ℃，反應20 min。溶液2：9.67 mL CTAC與14.44 mL水混合加熱到60 ℃。將溶液2加至溶液1中，磁子攪拌500轉。加入210 μL TEOS攪拌40 min后，加入1∶1混合的TEOS(21 μL)和APTES-FITC(16.6 μL)，攪拌過夜。后處理：將攪拌過夜的混合物分散在溶解了2 g NH4NO3的100 mL無水乙醇中，90 ℃加熱回流45 min，直至溶液澄清。將澄清溶液分散在1∶9混合的HCl和無水乙醇中，加熱回流45 min。離心洗滌3次，分散到無水乙醇中。即合成了核上包覆FITC、殼上修飾氨基的核-殼介孔SiO2載體。

1.3 CMS對5F的負載和釋放

將5F溶于DMSO中，加水或磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋，制備成DMSO體積分數為3%的溶液。加入超聲分散的CMS，磁子攪拌24 h，分別用無水乙醇和水離心洗滌數次，以除去未負載的5F，由此得到CMS@5F。將合成的CMS@5F(1 mg)分別分散在20 mL PBS(pH=7.4)和乙酸緩沖溶液(pH=5.0)中，置于10 000 Ka的透析膜中，室溫攪拌進行透析。在特定的時間點，取出8 mL透析膜外的水溶液用紫外-可見分光光度計在242 nm處測量吸收強度，換算5F的濃度，同時補充8 mL的緩沖溶液。

1.4 CMS在細胞中的分布

CNE2細胞分別用20/50/100 μg/mL的CMS@FITC孵育4 h后，用PBS 洗滌細胞2～3次，用4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS 洗滌細胞2～3次后用，共聚焦顯微鏡檢測FITC的熒光。FITC用氬離子激光器在488 nm進行激發(fā)，發(fā)射信號在485～550 nm范圍內收集。

1.5 CCK-8實驗

將CNE2細胞以4 000個/孔的密度種在三塊96孔板中，分別加不同濃度5F、CMS及CMS@5F，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔中加10 μL CCK-8繼續(xù)孵育0.5～4 h(根據顏色變化判斷孵育時間)，用酶標儀測定在450nm處的吸光度(OD值)，計算CNE2細胞的存活率。

1.6 Caspase-3活性實驗

細胞的Caspase-3活性用相應試劑盒來評估，通過nanodrop檢測405 nm處的吸收，吸光度數值越高說明活性越高。

1.7 Western blot比較5F及CMS@5F對磷酸化蛋白激酶(p-ERK1/2)的抑制作用

用濃度一致的5F、CMS及CMS@5F處理細胞后，倒掉培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)皿倒扣在吸水紙上吸干培養(yǎng)液，用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞三次。將培養(yǎng)皿置于冰上，加入裂解液裂解細胞30 min。用細胞刮將裂解后的細胞刮下，移至1.5 mL離心管中，在4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液，用BCA試劑盒標定蛋白濃度。根據目的蛋白的大小選擇濃縮膠和分離膠的濃度，上樣跑電泳、轉膜及顯影。目的條帶的寬度直觀的反應了5F及CMS@5F對磷酸化蛋白激酶(p-ERK1/2)及下游蛋白p-MSK1的抑制作用。

2 結果與討論

2.1 熒光標記CMS的表征

圖 1 CMS的透射電鏡(TEM)圖片Fig.1 TEM image of CMS

根據文獻合成了包覆FITC、最外層修飾氨基的介孔核殼(CMS)，從透射電鏡(TEM)圖上可以看到CMS直徑大概為80 nm，表面有明顯的介孔孔道，并且分散性較好(圖1)。表面修飾的氨基使CMS殼層帶正電荷，可通過靜電相互作用負載帶負電荷的5F。

CMS用作載體，首先要考慮其是否具有生物相容性，用不同濃度CMS孵育CNE2細胞24 h后用CCK-8試劑盒檢測細胞毒性，結果顯示CMS濃度高達200 μg/mL時對細胞活性也沒有明顯抑制作用，說明CMS對細胞而言是無毒的(圖2)。圖3的藥物釋放曲線是根據CMS@5F在pH=7.4的PBS或pH=5.0的乙酸緩沖溶液中釋放的5F比率做出的。通過圖中兩條釋放曲線的對比可以明顯看出5F在酸性溶液中更容易從CMS的孔道和表面釋放以發(fā)揮其治療作用。微環(huán)境的酸度變化會影響5F與CMS之間的靜電相互作用，使CMS釋放5F。

圖2 CMS對細胞活性的影響Fig.2 The influence of CMS on cell viability

圖3 在不同緩沖溶液中5F的釋放曲線Fig.3 The release curves of 5F in different buffer solutions

2.2 CMS在細胞中的分布

CMS是通過內吞作用進入細胞的，為了更直觀的觀察CMS在細胞中的分布，用不同濃度的CMS孵育CNE2細胞4 h后用共聚焦顯微鏡觀察FITC的熒光。從圖4中可以看到隨著濃度的增加，CMS進入細胞的量明顯增多。由于CMS是納米級的，所以可以看到FITC的熒光在細胞中是點狀分布的，這說明CMS能很好的將5F運送到細胞中。

圖4 CMS在CNE2細胞中的分布 Fig.4 The distribution of CMS in CNE2 cells (a)20 μg/mL;(b) 50 μg/mL;(c) 100 μg/mL

2.3 5F和CMS@5F的細胞毒性

通過CCK-8實驗評估5F和CMS@5F在不同濃度孵育CNE2細胞24 h后的細胞毒性。從圖5中可以看出5F和CMS@5F都有明顯的細胞毒性，并隨著5F濃度的增加而增強。我們檢測了5～100 μg/mL濃度范圍內的5F和5F@CMS孵育細胞24 h后對細胞的毒性，結果顯示在相同條件下CMS@5F的細胞毒性明顯高于單獨的5F。當CMS@5F的濃度為50 μg/mL時對細胞的抑制率基本達到100%，而相同濃度5F對細胞的抑制率僅為43%。CMS@5F細胞毒性增強主要是借助了CMS的細胞內吞作用，該作用能有效增大5F在細胞內的局部濃度，誘導細胞凋亡。

我們還檢測了與細胞凋亡相關的關鍵DAMP生物標志物半胱天冬酶-3(caspase-3)在細胞中的濃度水平(圖6)，結果顯示CMS@5F處理細胞的caspase-3吸光度明顯高于5F處理的細胞，這進一步證明了CMS@5F對細胞增殖的抑制效果更好。

圖5 不同濃度5F和CMS@5F對細胞生長的抑制Fig.5 The inhibition of cell growth by 5F and CMS@5F of different concentrations

圖6 CNE2細胞用5F和CMS@5F處理后caspase-3的活性Fig.6 Activity of caspase-3 in CNE2 cells treated with 5F and CMS@5F

2.4 基因表達分析

圖7 凋亡相關蛋白的WB分析Fig.7 Western blotting analysis results of apoptosis related proteins1.Control；2.30 μg/mL 5F;3.5 μg/mL CMS + 30 μg/mL 5F； 4.70 μg/mL 5F；5.5 μg/mL CMS + 70 μg/mL 5F；6.100 μg/mL 5F； 7.5 μg/mL CMS + 100 μg/mL 5F.

為了比較5F和CMS@5F在細胞基因層面引起的差異，我們用不同濃度的5F和CMS@5F處理細胞提取蛋白進行western blot(WB)分析。我們選擇了一條重要的細胞增殖和凋亡調控通道，即絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)信號轉導通道作為研究對象。理論上，干擾該信號通路的部分級聯通路可實現抗癌效果。而與多種異常腫瘤的發(fā)展密切相關的早期應答激酶(細胞外調節(jié)蛋白激酶，ERK)就是MAPK家族的一員。ERK信號轉導模式是從多種生長因子開始的，Ras-Raf-MSK到細胞生長、發(fā)展、分裂和分化，其中MSK是ERK的下游靶分子。在生理過程中，ERK和MSK被激活為p-ERK和p-MSK，兩者表達水平越高說明細胞增殖越明顯。從圖7中可以看到CMS@5F比5F處理的細胞p-ERK和p-MSK表達水平更低，說明CMS負載5F能有效促進抗癌藥物對癌細胞的抑制。

3 結論

綜上所述，本研究設計了一個藥物釋放體系負載抗癌藥物5F用于鼻咽癌細胞的抑制，5F是通過靜電引力吸附在CMS的表面和孔道中的。研究發(fā)現，CMS具有優(yōu)良的生物相容性，在細胞層面沒有毒性，能將抗癌藥物很好的輸送到癌細胞中。我們選擇具有代表性的鼻咽癌細胞CNE2作為研究對象來證明CMS在細胞層面對抗癌藥物療效的促進作用，結果證明CMS@5F對癌細胞的抑制效果更好，同時凋亡相關的蛋白表達水平更低。因此，我們期望該藥物釋放體系的設計能更多用于抗癌藥物的負載和釋放，以提高藥物的治療效果。