孔凡鵬， 時曉慧， 舒迎爭， 范楠楠， 梁慕文， 唐 波

(分子與納米探針教育部重點實驗室，山東師范大學化學化工與材料科學學院，山東濟南 250014)

1 引言

細胞與活體中的小分子(Rective Small Molecules,RSMs)通過維持分子網(wǎng)絡的動態(tài)平衡來實現(xiàn)對生命活動的調控，它們中的活性小分子變化行為與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。準確檢測這些生物活性小分子，探究它們參與的相關信號轉導過程，對剖析重大疾病發(fā)生和發(fā)展的分子機制以及診療意義重大。在眾多成像技術中，熒光成像技術具有許多優(yōu)點[1 - 3]，如：可達到單分子檢測的高靈敏性、可控,可實現(xiàn)對亞細胞器及納秒級的時空分辨。近年來，越來越多的結構多樣、靈敏度高、選擇性好的小分子熒光探針被應用于活細胞與活體內活性分子的成像檢測[4 - 6]。

2 國內外研究現(xiàn)狀

2.1 還原性活性小分子的熒光檢測

谷胱甘肽(GSH)是細胞內含量最豐富的小分子巰基化合物，在清除體內毒素和自由基的過程中發(fā)揮著關鍵作用[9]。GSH含量的異?？赡軐е掳┌Y、衰老、心血管疾病以及其他病癥。Kim研究組[10]設計合成了能定位于線粒體的近紅外熒光探針1用于特異性檢測GSH(圖1)。由于硝基偶氮苯對花菁母體的熒光猝滅效應，該探針本身無熒光，GSH使硝基偶氮苯從花菁母體上解離，從而使近紅外熒光恢復。在HeLa細胞中進行的共聚焦成像顯示，探針作為線粒體內GSH示蹤劑，其性能優(yōu)于目前商業(yè)化的GSH探針和線粒體定位染料。Yoon研究組[11]設計合成了一種以花菁為母體，5-二甲氨基-丹酰胺作為識別基團的特異性檢測GSH的近紅外熒光探針2(圖1)，并成功應用于對小鼠體內的肝臟、腎臟、脾臟和肺等器官中GSH水平變化實時監(jiān)測。

圖1 探針1和2的結構及其響應機理Fig.1 Structures and response mechanisms of probes 1 and 2

楊清正研究組[12]設計出一種以氯代BODIPY為母體的比率型熒光探針3(圖2)，該探針中的氯原子首先與巰基發(fā)生巰基-鹵素親核取代反應生成硫代BODIPY，Cys和Hcy結構中的氨基與硫原子發(fā)生重排形成氨基取代的BODIPY，而GSH與探針只發(fā)生巰基-鹵素親核取代反應形成硫代BODIPY，兩種不同取代的BODIPY呈現(xiàn)不同的光物理性質，從而實現(xiàn)探針對GSH 的特異性識別。Li研究組[13]以乙二醛腙為反應位點設計合成了一種近紅外熒光探針4(圖2)。GSH與探針中的醛基進行加成反應，隨后內酰胺水解開環(huán)形成具有強熒光的部花菁。而Cys或Hcy能與探針形成穩(wěn)定的五環(huán)或六環(huán)雜環(huán)，無法使內酰胺開環(huán)，部花菁熒光不能恢復，從而實現(xiàn)探針對GSH的特異性檢測。

圖2 探針3和4的結構及其響應機理Fig.2 Structures and response mechanisms of probes 3 and 4

H2S是繼NO和CO之后的第三種氣體信號分子。研究發(fā)現(xiàn)H2S在許多生理過程中，例如在調節(jié)血壓、傳遞神經(jīng)信號等方面發(fā)揮著重要作用[14]。基于H2S可將疊氮還原為氨基的原理， Pluth研究組[15]設計合成了兩種熒光探針5和6(圖3)用于特異性檢測H2S。在H2S的作用下探針5結構中的疊氮還原為氨基，從而使內酯螺環(huán)結構開環(huán)，導致熒光顯著增強，利用該探針實現(xiàn)了斑馬魚體內H2S的可視化熒光成像。探針自身基本沒有熒光，與H2S反應后生成熒光團，同時釋放氧硫化碳，氧硫化碳在碳酸酐酶的作用下轉化為H2S。探針6區(qū)別于以往探針的最大特點在于反應消耗一分子H2S的同時釋放一分子H2S，從而保持生物樣品中H2S的濃度不變。

圖3 探針5和6的結構及其響應機理Fig.3 Structures and response mechanisms of probes 5 and 6

Bea研究組[16]設計合成測H2S濃度變化的比率型雙光子熒光探針7(圖4)。 并利用雙光子成像實現(xiàn)了對星形細胞和腦切片中由胱硫醚-β-合成酶催化產(chǎn)生的內源性的H2S的監(jiān)測?；贖2S與碳氮雙鍵的親核加成反應，郭子建研究組[17]設計合成了一種比率型熒光探針8該探針由香豆素和部花菁組成，在生理pH環(huán)境下，HS-與探針中碳氮雙鍵發(fā)生親核加成反應，使得探針652 nm處的特征發(fā)射峰熒光明顯下降，510 nm處特征發(fā)射峰熒光顯著增加，從而實現(xiàn)了探針對H2S的比率熒光檢測。采用該探針實現(xiàn)了對MC-7細胞線粒體中內源性H2S的可視化成像?；诖?lián)親核加成反應，唐波研究組[18]設計合成了一種以花菁為熒光母體的近紅外比率型H2S熒光探針9(圖4)。探針在780 nm處有熒光發(fā)射，H2S對醛基親核加成后，生成的巰基中間體進一步與酯羰基發(fā)生親核加成反應，釋放出酮式花菁，在625 nm處出現(xiàn)新的熒光發(fā)射峰。探針在625nm和780nm的熒光強度比值I625/I780與H2S濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。作者利用該探針，實現(xiàn)了對活細胞中內源性H2S的比率熒光成像檢測。

圖4 探針7，8和9的結構及其響應機理Fig.4 Structures and response mechanisms of probes 7,8 and 9

圖5 探針10和11的結構及其響應機理Fig.5 Structures and response mechanisms of probes 10 and 11

過硫化氫(H2S2)及多硫化氫(H2Sn，n>2)是H2S參與生命體內氧化還原反應的產(chǎn)物。因此，設計可選擇性檢測多硫化物的熒光探針具有非常重要的意義。Xian研究組[19]設計合成了首個可檢測H2S2的熒光探針10(圖5)。探針本身熒光微弱，當H2S2存在時，探針結構中的巰基與H2S2反應生成含有-S-SH的中間體，該中間體進一步發(fā)生分子內環(huán)化，形成含有二硫鍵的五元環(huán)脫去，釋放出熒光團，致使熒光顯著增加。以此探針實現(xiàn)了對H9C2細胞和HeLa細胞中H2S2的熒光成像檢測?；诙嗔蚧颒2Sn含有兩個-SH的結構特性，Xian研究組[20]設計合成了以熒光素為母體，含有兩個親電反應基團的熒光探針11(圖5)。探針本身基本沒有熒光，當H2S2存在時，巰基首先與氟原子發(fā)生親核取代反應，形成含有-S-SH結構的中間體，而中間體中的-SH可與酯羰基發(fā)生親核加成反應，然后消除含有二硫鍵的五元環(huán)，釋放出熒光素，使得熒光顯著增強。利用該探針實現(xiàn)了對HeLa細胞中H2S2的可視化熒光成像檢測。

圖6 探針12和13的結構及其響應機理Fig.6 Structures and response mechanisms of probes 12 and 13

硒在許多代謝過程中都起著至關重要的作用[24]，研究表明硒的生理功能依賴于其在生物體內存在的化學形態(tài)[25]。硒主要是以硒代半胱氨酸參與體內蛋白質、酶和輔酶的合成，進來研究表明硒對于癌癥具有預防和治療作用。唐波研究組[26]設計合成了一種以部花菁為熒光基團，苯并硒二唑為響應基團的熒光探針14(圖7)。在pH=7.4的生理條件下，探針結構中的苯并硒二唑與硒醇反應，生成鄰苯二胺供電子基團，熒光顯著增強，實現(xiàn)了對活細胞中硒醇的可視化熒光成像，并研究了Na2SeO3誘導的HepG2細胞凋亡與硒醇含量的關系。H2Se是體內硒元素重要的代謝中間體，涉及多種病理生理學過程。唐波研究組[27]設計合成了一種近紅外熒光探針15(圖7)在細胞及活體內實現(xiàn)對H2Se的熒光成像。H2Se打斷探針結構中的硒氮鍵，將苯并硒二唑結構轉變?yōu)猷彵蕉饭╇娮芋w，致使熒光增強，熒光強度隨著H2Se濃度在一定范圍的增加而顯著加強，且兩者具有良好的線性關系。作者采用該探針并初步揭示了在乏氧條件下亞硒酸鈉的抗癌機制為非氧化脅迫作用。

圖7 探針14和15的結構及其響應機理Fig.7 Structures and response mechanisms of probes 14 and 15

硫氧還蛋白還原酶(TrxR)是一種重要的硒酶，房建國研究組[28]設計合成了以萘酰亞胺為熒光母體，環(huán)內二硫鍵為識別基團的熒光探針16(圖8)，用于檢測TrxR的酶活性。探針本身熒光很弱，與TrxR反應后，S-S鍵被-SeH進攻，使得S-S鍵斷裂，進而與酯羰基發(fā)生分子內的環(huán)化，形成的五元環(huán)脫落，釋放出萘酰亞胺熒光母體，利用該探針實現(xiàn)了對HepG2細胞內硫氧還蛋白還原酶的可視化成像。在檢測硫氧還蛋白還原酶基礎上，房建國研究組[29]設計篩選出了一種以香豆素為熒光母體的檢測硒醇的熒光探針17(圖8)。2,4-二硝基苯磺?；鳛槿彪娮拥臒晒忖缁鶊F與香豆素相連，使得探針本身熒光猝滅，在pH=7.4的生理條件下，R-Se-親核進攻探針的響應基團，致使2,4-二硝基苯磺?；撀洌愣顾氐臒晒饣謴?，實現(xiàn)了HepG2細胞內源性硒醇的可視化成像分析。

圖8 探針16和17的結構及其響應機理Fig.8 Structures and response mechanisms of probes 16 and 17

2.2 氧化性活性小分子的檢測

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)主要包括羥基自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧、羥基自由基和超氧陰離子等，它們在細胞信號轉導[30]和免疫[31]作用中起著重要的作用。然而,ROS濃度水平過高會破壞機體內生物分子，引起多種疾病[32]。

在諸多活性氧中，·OH氧化能力最強，能夠通過將蛋白質、糖類降解，使脂質過氧化和DNA斷裂，對細胞產(chǎn)生不可修復的損傷，影響生物體的生理學和病理學過程，進而引發(fā)各類疾病。Turro研究組[33]以2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基為識別基團設計合成了特異性檢測羥基自由基的熒光探針18(圖9)。探針結構中的氮氧自由基能捕獲·OH與二甲亞砜(DMSO)反應后產(chǎn)生的·CH3，導致羅丹明開環(huán)，熒光恢復，實現(xiàn)了對·OH的間接測定。利用該探針，實現(xiàn)了對PMA刺激下HepG2細胞線粒體中·OH的熒光成像。Tae 研究組[34]設計了一個以酰肼為識別基團的羅丹明類熒光探針19(圖9)用于特異性檢測·OH，并成功應用于A549細胞和RAW264.7細胞中·OH的熒光成像。張忠平研究組[35]基于熒光素染料設計合成了能區(qū)別HClO和·OH的熒光探針20(圖9)。 該探針與HClO反應時，內酰胺螺環(huán)打開，呈現(xiàn)熒光素的綠色熒光；而與氧化性更強的·OH反應時，熒光素中苯環(huán)被氧化開環(huán)，形成青色熒光產(chǎn)物。作者實利用該探針現(xiàn)了對活細胞線粒體中HClO和·OH的熒光成像檢測。

圖9 探針18,19和20的結構及其響應機理Fig.9 Structures and response mechanisms of probes 18,19 and 20

基于PET和形成分子間氫鍵的機理，劉志洪研究組[36]以酰肼為識別位點設計合成了檢測丙二醛的熒光探針21(圖10)，并利用該探針，實現(xiàn)了對H2O2刺激條件下HeLa細胞中丙二醛濃度變化的熒光熒光成像。林偉英研究組[37]以肼為識別基團設計合成了靶向線粒體檢測丙二醛熒光探針22(圖10)，并實現(xiàn)了HeLa細胞中丙二醛的熒光成像。

圖10 探針21和22的結構及其響應機理Fig.10 Structures and response mechanisms of probes 21 and 22

圖11 探針23和24的結構及其響應機理Fig.11 Structures and response mechanisms of probes 23 and 24

圖12 探針25,26和27的結構及其響應機理Fig.12 Structures and response mechanisms of probes 25,26 and 27

基于中位吡咯基團對BODIPY母體的“增強型”PET效應和能被HClO的選擇性氧化，彭孝軍研究組[43]設計合成了 “增強型PET”的HClO熒光探針28(圖13)，可用于超靈敏(檢測限為0.56 nmol)、快速、高選擇性地檢測癌細胞內本真次氯酸的含量。該探針被用于對癌細胞內HClO和由伊利司莫誘導MCF-7細胞HClO濃度波動進行成像。HBrO的缺乏會影響膠原蛋白的活性，進一步影響動物的發(fā)育，唐波研究組[44]設計合成了一種極易商品化的小分子熒光探針29用于HBrO超靈敏檢測(圖13)。該探針通過HBrO催化產(chǎn)生共軛度擴增產(chǎn)物，極大提高信噪比，首次成功區(qū)分了正常細胞與腫瘤細胞內HBrO水平的差異，以及斑馬魚不同發(fā)育期體內HBrO分布的狀況。因此，探針29將成為一種有前景的實用探針材料用于HBrO調控膠原蛋白活性及膠原蛋白過量表達的生物學效應研究?；谂鹚狨ズ土騼弱ルp識別基團，Yoon研究組[45]設計合成了一種對HClO特異性響應的熒光探針30(圖13)。該探針只有在ClO-作用下，發(fā)生芳基硼酸酯和硫內酯水解，形成熒光素。利用該探針，實現(xiàn)了對果蠅體內ClO-熒光成像。馬會民研究組[46]以硫內酯為識別基團構建了能定位于線粒體ClO-的熒光探針31(圖13)。并對處于細菌感染期的巨噬細胞的線粒體中的ClO-進行了熒光成像。

圖13 探針28，29，30和31的結構及其響應機理Fig.13 Structures and response mechanisms of probes 28,29,30 and 31

基于硒化物消除反應，江華研究組[47]設計合成了兩種基于的對HClO特異性響應的熒光探針32(圖14)，并成功應用于Raw264.7細胞中HClO的熒光成像。基于PET機理，以硒醚為識別基團，唐波研究組[48]設計合成了一種用于可逆檢測HClO的雙光子熒光探針33(圖14)。并成功地對在斑馬魚和小鼠中的HClO水平進行了雙光子熒光成像。Yoon研究組[49]以咪唑啉-2-硫酮為識別基團設計合成了對ClO-特異性響應的熒光探針34(圖14)，并利用雙光子熒光成像技術，對活細胞和組織中ClO-進行的成像分析。

圖14 探針32,33和34的結構及其響應機理Fig.14 Structures and response mechanisms of probes 32,33 and 34

活性氮(RNS)是生物體內另一類重要氧化性活性物種[50 - 51]，其主要包括NO、NO2、過氧亞硝酰、硝酰等。RNS在各種生理和病理過程中起重要作用，如NO是重要的氣體信號分子，在調節(jié)血壓、傳遞神經(jīng)信號等方面發(fā)揮著重要作用[52 - 53]；過氧亞硝酰能氧化脂質、蛋白質、碳水化合物和DNA，從而導致心血管疾病、神經(jīng)性疾病、炎癥和癌癥產(chǎn)生。因此，在細胞與活體內特異性檢測RNS具有重要的意義。Nakagawa研究組[54]設計合成了第一個不含金屬離子的檢測活細胞內硝酰的分子熒光探針35(圖15)。通過三苯基膦與硝酰的反應形成氮雜內鎓鹽導致羅丹明熒光團的開環(huán)，產(chǎn)生強熒光。錢旭紅研究組[55]設計合成了用于檢測過氧亞硝基陰離子的三通道熒光探針36(圖15)。在過氧亞硝氧化作用下，經(jīng)歷一個橙色發(fā)光中間體37后，形成紅色的試鹵靈衍生物38，其他ROS和RNS對于過氧亞硝酰的檢測均不產(chǎn)生干擾。該探針已成功地應用于活細胞內源性過氧亞硝酰陰離子的熒光成像。

圖15 探針35和36的結構及其響應機理Fig.15 Structures and response mechanisms of probes 35 and 36

2.3 金屬離子的檢測

在生物體內，鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、鋅等金屬離子廣泛參與生命過程，它們是維持生命活動所必需的元素[56]。銅是一種必須的微量元素，它常以輔基的形式參與細胞內多種重要的代謝途徑。如在賴氨酸氧化酶參與結締組織的形成和胺原交聯(lián)，超氧化物歧化酶清除體內自由基，細胞內銅離子調控這些酶的活性，其濃度影響這些酶的功能的發(fā)揮[57 - 58]。Taki研究組[59]設計了第一個反應型的Cu(Ⅰ)熒光探針39(圖16)， Cu(Ⅰ)催化氧化使探針結構中芐基醚C-O鍵斷裂，導致熒光素熒光恢復。Chang研究組[60]基于與銅離子螯合的硫醚基團和線粒體定位基團三苯基鏻設計了熒光探針40(圖16)，該探針能有效地檢測線粒體內的銅離子濃度變化，并成功應用于監(jiān)測抗壞血酸鹽誘導C6細胞中Cu(Ⅰ)的濃度波動。Chang研究組[61]還設計了一種基于雜化熒光素Cu(Ⅱ)熒光探針41(圖16)，探針結構中三氟甲基可使芳基-芳基旋轉的非輻射衰減最小化，進而提高熒光團的量子產(chǎn)率。研究者利用該探針研究了Cu(Ⅱ)在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮的生理作用。

圖16 探針39,40和41的結構式Fig.16 Structures of probes 39,40 and 41

K+是生物體中最為豐富的金屬離子之一， K+除了與Na+一起維持細胞內外滲透壓及電解質平衡，在肌肉收縮、神經(jīng)傳遞、腎臟功能等諸多方面發(fā)揮至關重要的作用[62]。人體中K+的失衡是許多疾病的誘因，如心臟病、糖尿病、癌癥等。因此，急需發(fā)展高選擇性、高靈敏度的檢測細胞及活體中K+的熒光探針。Meldrum研究組[63]報道了一個高選擇性檢測線粒體中K+的熒光探針42(圖17)。探針結構以氮雜穴狀配體作為K+識別基團，以親脂性三苯基膦陽離子結構定位線粒體，以BODIPY作為熒光團。該探針能很好地響應30～500 mmol/L的K+，且pH值及其他各種金屬離子不干擾。作者利用該探針成功可視化了HeLa及U87MG細胞在離子霉素誘導下線粒體中K+的外流。

唐波研究組[64]設計合成了一個近紅外熒光探針43(圖17)，結合微流控芯片技術，實現(xiàn)了單個正常/腫瘤細胞中Na+和K+的同時定量分析。探針主體結構為氮雜BODIPY結構，其空腔結構識別Na+、K+離子。結合微流控芯片技術，該探針能準確定量檢測單個HepG2細胞內Na+和K+的濃度。方法被用于檢測正常/腫瘤細胞內Na+和K+的濃度比率，結果表明腫瘤細胞具有更高的Na+/K+比值。最后，該探針被成功應用于檢測白藜蘆醇誘導的HepG2細胞凋亡過程中Na+和K+的濃度變化。

圖17 探針42和43的結構式Fig.17 Structures of probes 42 and 43

鐵是人體中含量最豐富的過渡金屬，主要分布在血紅細胞中。鐵能與生物分子產(chǎn)生各種鍵合作用，作為活性中心形成酶、激素等，從而發(fā)揮電子轉移、載氧等重要的生理功能[65 - 66]。Chang研究組[67]設計了一種高靈敏度、高選擇性的Fe2+催化氧化反應型熒光探針44(圖18)，用于檢測活細胞中的Fe2+。探針44加入Fe2+后在有氧環(huán)境中發(fā)生氧化脫烷基化作用，C-O鍵斷裂，熒光素共軛體系恢復。該探針對Fe2+具有特異性，并成功應用于檢測鐵調素、抗壞血酸誘導的肝細胞中Fe2+濃度變化?；诠庹T導電子轉移(PET)機理，Chang研究組[68]還發(fā)展了一種高靈敏度、高選擇性的Fe2+熒光比率成像探針45(圖18)。探針以1,2,4-三氧雜環(huán)戊烷為識別基團，以5-氨甲基熒光素(5-AMF)為熒光供體和花菁(Cy3)為熒光受體，通過三氧雜環(huán)與Fe2+發(fā)生芬頓反應前后呈現(xiàn)FRET比率信號，實現(xiàn)對Fe2+的熒光比率成像。利用該探針，作者研究了正常人類乳腺上皮細胞(HEK 293T)和人類乳腺癌細胞(MCF-10A)、人類骨癌細胞(MDA-MB-231)的比率熒光成像，驗證了腫瘤細胞中Fe2+的濃度變化幅度超過正常細胞。

圖18 探針44和45的結構及其響應機理Fig.18 Structures and response mechanisms of probes 44 and 45

2.4 pH值熒光探針

細胞內穩(wěn)定的pH對有機體正常生理功能的維持至關重要[69 - 70]， pH失衡會導致細胞生長和分化異常、細胞功能紊亂，進而影響到神經(jīng)系統(tǒng)以及誘發(fā)多種疾病。唐本忠研究組[71]通過將四苯乙烯與部花菁偶聯(lián)，設計合成了一種聚集誘導(AIE)型的pH熒光比率探針46(圖19)，并將其成功應用于HeLa細胞溶酶體內pH的熒光比率成像。

圖19 探針46的結構及其響應機理Fig.19 Structures and response mechanisms of probe 46

基于可定位于溶酶體的嗎啉基團，馬會民研究組[72]設計合成了近紅外熒光比率pH探針47(圖20)。并利用該探針，實現(xiàn)了熱休克情況下MCF-7細胞溶酶體內pH的變化的熒光成像，并證明熱休克會引起溶酶體pH值的增加，且這一過程在活細胞中是不可逆的。Kim研究組[73]基于苯并咪唑設計合成了能夠檢測酸性pH值變化的雙光子熒光比率探針48(圖20)，并對HeLa細胞溶酶體內和小鼠大腦組織中pH值進行了雙光子成像。

圖20 探針47和48的結構及其響應機理Fig.20 Structures and response mechanisms of probes 47 and 48

Cho研究組[74]利用嘧啶上N原子質子化設計合成了雙光子比率pH熒光探針49(圖21)，并對人的胃和食管組織的pH變化進行比率成像，成功地區(qū)分了正常的食管和發(fā)炎的食管。Kim研究組[75]將對酸性pH值敏感的羅丹明和對堿性pH值敏感的熒光素相連合成了對寬范圍pH(3～10)檢測的熒光探針50(圖21)。作者利用該探針發(fā)現(xiàn)細胞的氧化還原平衡可以調控溶酶體內的pH。

圖21 探針49和50的結構及其響應機理Fig.21 Structures and response mechanisms of probes 49 and 50

3 展望

綜上，隨著化學生物學和醫(yī)學迅速發(fā)展，對應用于復雜的細胞及活體中熒光成像的小分子探針的性質和功能提出更高的要求。雖然與生理病理相關的重要活性小分子的熒光探針相繼被開發(fā)，但細胞與活體內大部分活性小分子含量低、活性高、分布狀況各異、合成與代謝迅速、生物效應多樣，這些特性對熒光探針的發(fā)展提出了更高的要求和新的挑戰(zhàn)。為了更能真實地反映生命的過程，結合熒光成像技術的發(fā)展，今后用于細胞與活體內活性小分子成像的熒光探針研究將會在今后聚焦于以下幾個方面：

(1)需發(fā)展量子產(chǎn)率高，波長位于近紅外(650～900 nm)或近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm)的熒光探針；或設計具有更大的吸收截面值的雙光子熒光探針，從而降低光在穿透生物組織中的散射及生物體自發(fā)熒光的影響，提高成像深度和空間分辨率，實現(xiàn)探針在活體成像中的成功應用。

(2)在保證識別特異性的前提下，發(fā)展新的識別機理，通過探針與活性小分子反應后，共軛程度擴展，熒光發(fā)射波長紅移，降低檢測背景，提高信噪比，實現(xiàn)對極低含量水平活性小分子的超靈敏檢測。

(3)在探針分子中引入與特定蛋白結合的錨定基團，提高探針在細胞與組織內駐留時間問題，實現(xiàn)對復雜生理和病理過程的長時間熒光成像。

(4)發(fā)展與活性小分子瞬時響應、動態(tài)可逆結合的熒光探針，精確示蹤細胞與活體內分子事件過程。

相信，隨著越來越多性能優(yōu)異的熒光探針的涌現(xiàn)，會使人們對生物活性小分子的認識與了解會更加全面深刻，會對小分子參與的重要生命過程及其對重大疾病發(fā)生發(fā)展的影響研究帶來新的機遇和新的希望。