呂維杰， 毛志強(qiáng)， 劉志洪

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

粘度是影響物質(zhì)在溶液中擴(kuò)散速率的重要參數(shù)之一[1]。粘度通過(guò)影響物質(zhì)的移動(dòng)性，對(duì)物質(zhì)的運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)識(shí)別及生物大分子相互作用有著極大的影響[2]。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)粘度的改變與粥樣硬化、糖尿病、阿爾茨海默病及腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系，是這些疾病潛在的指示指標(biāo)[3]。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的粘度具有非常重要的意義。不同于宏觀大體積粘稠流體的粘度的測(cè)定可以使用轉(zhuǎn)子粘度計(jì)、落球粘度計(jì)等儀器，細(xì)胞內(nèi)粘度的測(cè)定一般采用基于分子轉(zhuǎn)子的粘度探針。分子轉(zhuǎn)子是一類(lèi)特殊的熒光材料，其在激發(fā)態(tài)非輻射躍遷損失的能量隨粘度的改變而變化，粘度的增加會(huì)阻礙轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)，轉(zhuǎn)子非輻射躍遷損失的能量會(huì)減少，具體的表現(xiàn)為轉(zhuǎn)子的熒光強(qiáng)度升高[1]。

目前已報(bào)道的分子轉(zhuǎn)子大多發(fā)射波長(zhǎng)較短(<550 nm)，會(huì)有比較強(qiáng)的生物背景熒光干擾，且短波的穿透深度有限，不利于生物成像[4 - 5]。為了解決上述問(wèn)題，本文通過(guò)共軛雙鍵連接吸電子基和給電子基,設(shè)計(jì)合成了紅光發(fā)射的分子轉(zhuǎn)子2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4-H-吡喃-4-亞基)-丙二腈(DCM-NH2)。該探針的最大發(fā)射波長(zhǎng)為631 nm，屬于遠(yuǎn)紅光，能有效減少生物背景，提高成像信噪比。同時(shí)，探針對(duì)粘度有很好的響應(yīng)，具有線性響應(yīng)范圍寬、靈敏度高、對(duì)粘度非常敏感等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司)；UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Chameleon Ultra Ⅱ型鈦藍(lán)寶石飛秒脈沖激光器(美國(guó)，相干公司)；Mercury 300型核磁共振儀(美國(guó)，瓦里安)。

對(duì)甲?；脚鹚豳?gòu)于上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司(安耐吉)；哌啶、乙酸銅、冰乙酸均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-(2-甲基-4-H-吡喃-4-亞基)-丙二腈(DCM)根據(jù)文獻(xiàn)方法[6]合成；依文獻(xiàn)用不同體積比的甘油-甲醇配制不同粘度的溶液[7]；所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室所用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

DCM-NH2的合成路線如圖1所示。

圖1 DCM-NH2的合成路線Fig.1 The synthesis schematic diagram of DCM-NH2

1.2.14-疊氮苯甲醛(PhN3)的合成稱(chēng)取對(duì)甲?；脚鹚?50 mg(5 mmol)，疊氮鈉450 mg(7 mmol)，一水CuAc2100 mg(0.5 mmol)加入到100 mL單口瓶中 ，溶于30 mL甲醇，通氬氣保護(hù)下，55 ℃ 回流3 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去甲醇，粗產(chǎn)品用柱層析色譜分離，淋洗劑為二氯甲烷，真空干燥，得到淡黃色油狀液體(400 mg,54%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3),δ:9.95(s,1H),7.89(d,J=8 Hz,2H),7.17(d,J=8 Hz,2H)。

1.2.2DCM-NH2的合成將150 mg(1 mmol)PhN3和208 mg(1 mmol) DCM溶于20 mL甲苯中，室溫?cái)嚢柘录尤?.5 mL哌啶，0.5 mL冰HAc，然后120 ℃通氬氣保護(hù)下反應(yīng)10 h，減壓蒸餾除去甲苯，粗產(chǎn)品用柱層析色譜分離，淋洗劑為甲醇/二氯甲烷(1∶50,V/V)，真空干燥，得到暗紅色固體(65 mg,20%)。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO),δ:8.71(d,J=8 Hz,1H),7.88(t,J=8 Hz,1H),7.76(d,J=8 Hz,1H),7.63(d,J=16 Hz,1H),7.57(t,J=8 Hz,1H),7.48(d,J=8 Hz,2H),6.85(s,1H),6.61(d,J=8 Hz,2H),6.05(s,2H)。

1.2.3熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的DCM-NH2，溶于二甲亞砜(DMSO)中，配制為1 mmol/L 的母液待用；然后取母液，采用不同的溶劑稀釋到1 μmol/L，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定其吸收光譜，記錄最大吸收波長(zhǎng)和最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度。然后將溶液稀釋到最大吸光度在0.05以下，測(cè)定其發(fā)射光譜用作計(jì)算熒光量子產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 DCM-NH2在不同粘度溶液中量子產(chǎn)率的測(cè)定

為了探究分子轉(zhuǎn)子對(duì)粘度是否有響應(yīng)，首先測(cè)定了DCM-NH2在三種不同粘度環(huán)境下的熒光量子產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著粘度的增加，探針的熒光量子產(chǎn)率變大，量子產(chǎn)率從低粘度中的1.8%變?yōu)楦哒扯认碌?.2%，增加了2.89倍。這些結(jié)果表明粘度的增加阻礙了分子轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)，DCM-NH2非輻射躍遷損失的能量變少，探針的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。由此可以看出，DCM-NH2對(duì)粘度有響應(yīng)。

表1 DCM-NH2在不同粘度溶液中的量子產(chǎn)率

2.2 DCM-NH2在不同溶劑中的光譜性質(zhì)

為考察溶劑極性對(duì)DCM-NH2的熒光變化的影響，分別測(cè)試了DCM-NH2在二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、四氫呋喃中的光譜性質(zhì)。由圖2可以看出， DCM-NH2在這些溶劑中的吸收和發(fā)射光譜基本不變，最大吸收波長(zhǎng)最多改變了18 nm(467～485 nm)，最大發(fā)射波長(zhǎng)最多改變了12 nm(651～663 nm)。上述結(jié)果表明DCM-NH2的熒光性質(zhì)不受溶劑極性的影響。

圖2 DCM-NH2在不同溶劑中的紫外吸收光譜(A)和熒光發(fā)射光譜(B)(歸一化后) Fig.2 The normalized absorption(A) and fluorescence spectra(B) of DCM-NH2 in different solvents 1.DCM;2.Acetone;3.Acetonitrile;4.Ethanol;5.Methanol;6.THF.

2.3 DCM-NH2選擇性的考察

2.4 DCM-NH2pH穩(wěn)定性的測(cè)定

為了排除pH對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響，測(cè)試了溶劑體系中pH值的改變對(duì)熒光強(qiáng)度的影響(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH=4～9的范圍內(nèi)，DCM-NH2的熒光強(qiáng)度基本保持不變，表明DCM-NH2對(duì)pH不敏感，具有很好的pH穩(wěn)定性。

圖3 DCM-NH2對(duì)常見(jiàn)離子的響應(yīng)Fig.3 Fluorescence responses of DCM-NH2(5 μmol/L) to viscosity and various ions(500 μmol/L)

圖4 DCM-NH2對(duì)pH的響應(yīng)Fig.4 Fluorescence responses of DCM-NH2(5 μmol/L) to various pH

2.5 DCM-NH2對(duì)粘度的響應(yīng)

在證明了DCM-NH2對(duì)粘度具有良好的選擇性和靈敏度的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了DCM-NH2對(duì)不同粘度的熒光響應(yīng)。從圖5A結(jié)果可知，隨著溶液粘度的增加，染料的熒光逐漸增強(qiáng)。在低粘度區(qū)和高粘度區(qū)，熒光強(qiáng)度與粘度表現(xiàn)出兩種線性曲線，熒光強(qiáng)度與粘度η均符合F?rster-Hoffmann方程:

logIf=c+xlogη

(3)

其中，If為染料熒光強(qiáng)度,c為與濃度和溫度相關(guān)的常數(shù)，x為與染料和溫度相關(guān)的常數(shù)，η為溶劑的粘度。在低粘度區(qū)(0.6～30.6 cP)，logIf=(0.033±0.0013)logη+c，R2為0.99；在高粘度區(qū)(30.6～458.6 cP)，logIf=(0.20±0.014)logη+c，R2為0.98。由此可以看出，DCM-NH2對(duì)粘度有著非常好的線性響應(yīng)，其線性響應(yīng)范圍非常寬(0～458.6 cP)。同時(shí)DCM-NH2最大發(fā)射波長(zhǎng)為631 nm，屬于遠(yuǎn)紅光，能有效降低生物背景，提高成像信噪比，非常適于生物成像。因此，探針具有檢測(cè)細(xì)胞中粘度的應(yīng)用前景。

圖5 不同粘度溶液中DCM-NH2(10 μmol/L)的熒光發(fā)射光譜(A)及熒光強(qiáng)度對(duì)數(shù)與溶液粘度對(duì)數(shù)的線性關(guān)系(B)Fig.5 The Fluorescence spectra(λex = 500 nm)(A) and linear relationship between logIf and logη(B)

圖6 不同波長(zhǎng)下的雙光子活性截面Fig.6 Two-photon action cross section of DCM-NH2

2.6 DCM-NH2雙光子熒光截面的測(cè)定

基于DCM-NH2優(yōu)良的檢測(cè)性能，同時(shí)考慮到雙光子熒光探針在成像上具有背景熒光低、光損傷小、成像深度大的優(yōu)點(diǎn)，我們對(duì)DCM-NH2的雙光子吸收性質(zhì)進(jìn)行了考察(圖6)。從圖6可以看出在780～840 nm雙光子激發(fā)波長(zhǎng)范圍內(nèi)，DCM-NH2具有雙光子吸收性質(zhì)。在820 nm激發(fā)下DCM-NH2具有最大的雙光子活性截面(Φδ)24 GM(1 GM = 10-50cm4·s·photons-1·melecule-1),表明DCM-NH2可望用于細(xì)胞或組織中粘度的雙光子成像。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并合成了基于扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的紅光發(fā)射的分子轉(zhuǎn)子DCM-NH2，該探針對(duì)粘度有很好的線性響應(yīng)，探針的線性響應(yīng)范圍寬(0.6～458.6 cP)，靈敏度高，同時(shí)該探針具有紅光發(fā)射特性，穿透深度深且能有效降低生物背景，有利于生物成像。