蘇 萍， 陳肖男， 楊 屹

(北京化工大學(xué)理學(xué)院，北京 100029)

蛋白質(zhì)是一類重要的生物活性大分子，在基因表達、新陳代謝、免疫反應(yīng)及物質(zhì)運輸?shù)壬顒又邪l(fā)揮著不可替代的作用，可作為正常生理功能或疾病狀態(tài)的客觀評價指標(biāo)。蛋白質(zhì)的分離與純化是蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及基因?qū)W等研究領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)[1 - 2]。目前，蛋白質(zhì)的分離方法主要有固相萃取[3]、雙水相萃取[4]、固定化金屬離子親和色譜[5]、分子印跡[6]、電泳[1,7]和免疫親和富集[8]。免疫親和富集是一種基于抗原-抗體間特異性反應(yīng)的分離技術(shù)，因其具有特異性好、靈敏度高、分離速度快等優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域備受青睞。

近年來，多種材料已被報道用作抗體的固定化載體，如硅球[9]、碳納米管[10]、金納米粒子[11]和磁性材料[12 - 13]等。在上述材料中，磁性材料具有比表面積大、生物相容性好、磁響應(yīng)性強、表面易修飾性等優(yōu)點，已成為研究的熱點[14]。目前，免疫磁球(IMMs)已初步應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品中一些蛋白質(zhì)的分離與純化[8]，但其實際應(yīng)用仍受到局限，因此，發(fā)展更有效的IMMs制備方法以及進一步拓展其應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的實際意義。

本文在前期研究[15]工作基礎(chǔ)上，通過戊二醛法制備了IMMs。以牛血清白蛋白(BSA)為模板蛋白質(zhì)，IMMs為吸附劑，建立了免疫親和富集-熒光光譜法用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離與檢測。通過優(yōu)化免疫親和富集的實驗條件，實現(xiàn)了對人血清樣品基質(zhì)中BSA的選擇性分離與檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

TCS SP5Ⅱ激光共聚掃描電鏡(CLSM)(德國，Leica)；Tecnai 20透射電子顯微鏡(TEM)(荷蘭，Philip)；7410振動樣品磁強計(VSM)(美國，Lake Shore CryotronicsInc)；F-7000熒光光譜儀(日本,Hitachi)；UltrafleXtreme基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS，德國,Bruker Daltonics)。

牛血清白蛋白(BSA，美國Sigma公司)。戊二醛、氰基硼氫化鈉(百靈威科技有限公司)。吐溫-20、異硫氰酸熒光素(FITC)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。參照文獻方法制備BSA多克隆抗體(pAb)(以BSA為免疫原)[16]和氨基化的Fe3O4磁球(MMs)[15]。

1.2 實驗方法

1.2.1免疫磁球的制備采用戊二醛法合成IMMs，具體步驟為：于20 mg MMs中加入500 μL戊二醛和4.5 mL 20 mmol/L PBS(pH=8.0)，29 ℃下?lián)u床反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，所得產(chǎn)物用10 mmol/L PBS(pH=7.4)洗滌3次，加入2 mL 2.5 mg/mL抗體溶液和20 mg氰基硼氫化鈉，29 ℃下?lián)u床反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用10 mmol/L PBS(pH=7.4)洗滌多次，加入2 mL 2%明膠溶液，29 ℃下?lián)u床反應(yīng)5 h。產(chǎn)物分散于10 mmol/L PBS(pH=7.4)中，4 ℃保存。

1.2.2熒光標(biāo)記物的制備用0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH=9.5)分別配制1 mg/mL的BSA溶液和0.2 mg/mL的FITC溶液。將上述FITC溶液加入BSA溶液中(體積比為1∶20)，邊加邊震蕩，25 ℃下?lián)u床避光反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在4 ℃下依次于0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH=9.5)中透析2 d、去離子水中透析1 d。透析結(jié)束后，產(chǎn)物FITC-BSA冷凍干燥后,于-20 ℃避光保存。FITC-pAb用類似方法合成，產(chǎn)物溶于10 mmol/L PBS(pH=7.4)中,于4 ℃保存。

1.2.3免疫親和富集稱取100 mg IMMs于離心管中，加入2 mL FITC-BSA溶液或人血清樣品溶液，37 ℃下?lián)u床避光反應(yīng)一定時間后，在磁鐵作用下棄去上層清液。用10 mmol/L PBS(pH=7.4)洗滌多次后，加入洗脫劑進行洗脫，洗脫液用熒光光譜法進行分析。

1.2.4熒光光譜分析取1 mL待測樣品溶液加入熒光比色皿中進行熒光分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性復(fù)合材料表征

圖1 激光共聚掃描電鏡(CLSM)表征：(A)FITC-pAb-MMs的暗場像；(B)FITC-pAb-MMs的明場像；(C)對比實驗：在不加入戊二醛的條件下，MMs與FITC-pAb反應(yīng)后液體的暗場像。TEM表征：(D)Fe3O4；(E)Fe3O4@SiO2；(F)IMMsFig.1 CLSM image:(A) dark field image of the FITC-pAb-MMs;(B) bright field image of the FITC-pAb-MMs;(C) control experiment:the MMs incubated with FITC-pAb conjugates without being modified by glutaraldehyde.TEM image:(D) Fe3O4;(E) Fe3O4@SiO2;(F) IMMsCLSM:The sample concentrations are about 1 mg/mL,and the excitation wavelength is 488 nm.TEM:The sample concentrations are about 0.5 mg/mL,and the voltage is 200 kV.

激光共聚掃描電鏡(CLSM)用于驗證抗體是否固定于磁球表面。用戊二醛法將FITC-pAb固定于磁球表面，用CLSM進行表征。由圖1A、1B可知，熒光是由FITC-pAb-MMs產(chǎn)生的，而不是游離的FITC小分子。由圖1C可知，不加入戊二醛時，無熒光現(xiàn)象，表明FITC-pAb與MMs間幾乎不存在物理吸附。上述結(jié)果表明，抗體在戊二醛作用下成功鍵合于磁球表面。

透射電鏡(TEM)用于直觀地觀察樣品形貌。由圖1D～F可知，合成的磁性材料均為單分散的球形結(jié)構(gòu)，F(xiàn)e3O4磁球表面經(jīng)過包硅、偶聯(lián)抗體處理后，粒子尺寸由450 nm增至510 nm左右，進一步表明抗體成功固定于磁球表面。

圖2 Fe3O4 (a)、MMs(b)和IMMs(c)的VSM表征圖Fig.2 Magnetization curves of Fe3O4 (a),MMs(b) and IMMs(c)

振動樣品磁強計(VSM)用于考察樣品的磁學(xué)性能。由圖2可知，三種磁性材料均表現(xiàn)出超順磁性，隨著磁球表面的修飾，其飽和磁化強度由80.06 emu/g下降至40.44 emu/g。上述結(jié)果表明，抗體成功固定于磁球表面，合成的IMMs仍具有良好的磁響應(yīng)性，可在磁場作用下實現(xiàn)快速分離。

2.2 免疫親和富集條件優(yōu)化

2.2.1洗脫劑的種類和濃度實驗考察了5種不同洗脫劑對富集效果的影響，結(jié)果如圖3A所示。由圖可知，甲醇作為洗脫劑時，回收率最高。因此，選用甲醇作為洗脫劑。實驗進一步考察了甲醇濃度對富集效果的影響。由圖3B可知，甲醇濃度為80%時，回收率最高。因此，選擇80%的甲醇溶液作為最佳的洗脫劑。

2.2.2富集時間實驗考察了不同富集時間對富集效果的影響，結(jié)果如圖3C所示。由圖可知，當(dāng)富集時間達10 min時，回收率達到最大值；富集時間超過10 min后，回收率基本保持不變。因此，選用10 min為最佳的富集時間。

2.2.3洗脫時間實驗考察了不同洗脫時間對富集效果的影響，結(jié)果如圖3D所示。由圖可知，當(dāng)洗脫時間達4 min時，回收率達到最大值；洗脫時間超過4 min后，回收率無明顯變化。因此，選用5 min作為最佳的洗脫時間。

圖3 (A)洗脫劑種類、(B)甲醇濃度、(C)富集時間和(D)洗脫時間對免疫親和富集效果的影響Fig.3 Effect of eluant solvent(A),methanol concentration(B),enrichment time(C) and elution time(D) on the performance of the immunoaffinity enrichmentConcentration of FITC-BSA:100 ng/mL;excitation and emission slits:5 nm;scanning speed:1 200 nm/min;excitation wavelength:488 nm.(A)Enrichment time:30 min;elution time:10 min.(B) Eluant solvent:methanol;enrichment time:30 min;elution time:10 min.(C) Eluant solvent:80%(V/V) methanol aqueous solution;elution time:10 min.(D) Eluant solvent:80%(V/V) methanol aqueous solution;enrichment time:10 min.

2.2.4等溫吸附曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線在上述最佳免疫親和富集條件下，考察了IMMs對目標(biāo)蛋白質(zhì)的飽和吸附容量。100 mg IMMs中加入2 mL不同濃度(0.02～20 μg/mL)的FITC-BSA溶液，免疫親和富集后用熒光光譜法檢測，得到的等溫吸附曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。由等溫吸附曲線可得，隨著FITC-BSA濃度由0.02 μg/mL增加至10 μg/mL，目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附量逐漸增加；當(dāng)FITC-BSA濃度為10 μg/mL時，吸附達到飽和；繼續(xù)增加FITC-BSA的濃度，目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附量幾乎不再增加。由此可得，IMMs對目標(biāo)蛋白質(zhì)的最大吸附量為107.7 μg/g。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，當(dāng)FITC-BSA濃度在0.02～5 μg/mL之間時，目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附量與FITC-BSA濃度之間呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=18.118x+0.9527，相關(guān)系數(shù)R2=0.9984(n=3，RSD <7%)，檢測限為0.02 μg/mL，上述結(jié)果表明IMMs適用于后續(xù)實驗中對目標(biāo)蛋白質(zhì)的富集與檢測。

2.3 重復(fù)使用性

實驗考察了制備的IMMs的重復(fù)使用情況，結(jié)果如圖5所示。由圖可知，IMMs重復(fù)使用10次后，回收率仍保持80%以上。上述結(jié)果表明，本實驗制備的IMMs具有良好的重復(fù)使用性。在免疫親和富集過程中，IMMs的質(zhì)量損失和抗體的少量失活引起回收率的略微降低。

圖4 FITC-BSA的等溫吸附曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(內(nèi)圖)Fig.4 Adsorption isotherm and calibration curve(inset) of FITC-BSAConcentration of FITC-BSA:0,0.02,0.1,1,3,5,7,10,15,and 20 μg/mL;excitation and emission slits:5 nm;scanning speed:1 200 nm/min;excitation wavelength:488 nm.

圖5 重復(fù)使用次數(shù)對免疫親和富集效果的影響Fig.5 Effect of the number of repeated use on the performance of the immunoaffinity enrichmentConcentration of FITC-BSA:100 ng/mL;excitation and emission slits:5 nm;scanning speed:1 200 nm/min;excitation wavelength:488 nm.

2.4 實際樣品分析

為了驗證該方法在實際復(fù)雜樣品中應(yīng)用的可行性和可靠性，實驗對人血清樣品基質(zhì)的BSA進行了分離檢測。將人血清樣品用10 mmol/L PBS(pH=7.4)稀釋100倍后，配制濃度為0.4 μg/mL和4 μg/mL的加標(biāo)樣品溶液。稱取100 mg IMMs加入上述溶液中，免疫親和富集目標(biāo)蛋白質(zhì)，并用熒光光譜法檢測，如表1所示。結(jié)果表明，在人血清樣品基質(zhì)中，免疫親和富集目標(biāo)蛋白質(zhì)的加標(biāo)回收率分別為97.5%和89.3%，IMMs對目標(biāo)蛋白質(zhì)的富集效果良好。為了進一步驗證該方法的特異性，洗脫后的蛋白質(zhì)樣品用MALDI-TOF-MS測定，結(jié)果如圖6A所示。質(zhì)譜圖中只在67.6 kDa和33.9 kDa處有峰，與FITC-BSA質(zhì)譜圖(圖6B)一致，表明該方法對目標(biāo)蛋白質(zhì)具有較強特異性。上述結(jié)果表明，該方法可應(yīng)用于人血清樣品基質(zhì)中目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性分離與檢測。

表1 免疫親和富集人血清樣品中BSA的回收率

圖6 (A)人血清加標(biāo)樣品中FITC-BSA洗脫液和(B)標(biāo)準(zhǔn)FITC-BSA的MALDI-TOF-MS譜圖Fig.6 MALDI-TOF-MS spectra of(A) the extrated FITC-BSA from spiked human serum samples and(B) the standard FITC-BSA solution(A) Spiked concentration:4 μg/mL;(B) about 1 mg/mL.

3 結(jié)論

本文采用戊二醛法成功制備了具有優(yōu)良的特異性、分散性和磁響應(yīng)性的IMMs，將其作為免疫親和富集吸附劑用于BSA的分離富集，并用熒光光譜法進行檢測。通過優(yōu)化免疫親和富集的條件，該方法成功應(yīng)用于人血清基質(zhì)中BSA的選擇性分離與檢測。方法具有操作簡便、特異性強、選擇性好、可重復(fù)使用等優(yōu)點，有望應(yīng)用于其它復(fù)雜生物樣品中生物活性大分子的分離與檢測。