趙 旭, 陳立功, 嚴(yán)秀平*,3

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))，江南大學(xué)食品學(xué)院分析食品安全學(xué)研究所，江蘇無錫 214122；2.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072;3.天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300071)

多年來，盡管眾多科研人員致力于腫瘤的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移機制的研究，且已取得了重要進展，但面對晚期癌癥尚無安全有效的治療方法[1]。癌癥的早期診治是提高癌癥患者治愈率的關(guān)鍵，也是亟需解決的問題。因此，研發(fā)特異性強、靈敏度高的檢測技術(shù)用于腫瘤早期診斷是十分必要的。光學(xué)成像技術(shù)具有非侵襲性、實時、靈敏度高、操作簡單以及可視性強等諸多優(yōu)勢，已成為腫瘤檢測的較理想方法[2]。尤其是近紅外熒光成像技術(shù)，因其吸收和發(fā)射波長均處于生物光學(xué)成像窗口內(nèi)，具有組織穿透能力強、生物組織的光吸收及自發(fā)熒光干擾小等優(yōu)勢而倍受青睞[3 - 5]。但傳統(tǒng)的成像探針大多為“always on”型顯影劑，一直處于熒光激活狀態(tài)的顯影劑在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)運過程中始終顯示出熒光信號，易造成自身背景干擾及“假陽性”結(jié)果[6]?；谀[瘤細(xì)胞弱酸性這一特性設(shè)計的pH激活型“off-on”可逆顯影劑，很大程度上避免了傳統(tǒng)“always on”型顯影劑存在的諸多不足，具有很高的信噪比，為腫瘤特異性成像帶來了福音[7 - 9]。

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達和活性明顯增強。這一特性使得糖類物質(zhì)在腫瘤靶向顯影領(lǐng)域備受關(guān)注，并取得了較理想的實驗效果[10 - 11]。此外，引入糖類物質(zhì)可增強化合物的生物相容性及水溶性。因此，在結(jié)構(gòu)設(shè)計時引入糖基是一種較好的選擇。我們設(shè)計合成了pH激活型近紅外不對稱菁類熒光探針，并選用氨基葡萄糖作為修飾基團以增強探針的水溶性及生物相容性，并賦予其腫瘤主動靶向功能。實驗中通過紫外-可見光譜及熒光滴定的方法確定了所合成探針的pH可逆激活特性及其pKa值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所合成探針具有較理想的pH響應(yīng)范圍，適用于腫瘤細(xì)胞特異性成像。此外，該化合物在測試濃度下未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，且在細(xì)胞水平實現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞弱酸性微環(huán)境的特異性成像。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(日本，日立公司)；UV 3600型紫外-可見-近紅外分光光度計(日本，島津公司)；TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國，萊卡公司)；核磁共振波譜儀(德國，布魯克公司)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，賽默飛世爾公司)；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(德國，賽多利斯公司)。

苯肼、三氯氧磷及冰HAc購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；3-溴丙酸乙酯、3-甲基-2-丁酮及環(huán)己酮購自百靈威科技有限公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽、氯乙酰氯 、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)購自阿拉丁試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等溶劑購于天津市康科德科技有限公司；無水SnCl2等其他試劑均為分析純，購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 實驗方法

1.2.1化合物的合成及結(jié)構(gòu)表征化合物的合成路線如圖1所示。

圖1 化合物的合成路線圖Fig.1 Synthetic routes of the compounds

參照我們先前報道的方法合成化合物1～7[12 - 13]。 目標(biāo)化合物的合成：取1.53 g(2.37 mmol)化合物7和氨基葡萄糖鹽酸鹽0.86 g(3.99 mmol)溶解于25 mL DMF中，加入1.0 mL(5.73 mmol)DIPEA。氮氣保護下，室溫攪拌5 h。然后將反應(yīng)液倒入100 mL水中，過濾得暗紅色固體。所得粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇=10∶1(V/V)，得目標(biāo)化合物2.75 g，收率為87.30%。

1H NMR (600 MHz,MeOD) δ(ppm)：8.14(1H,d,J=15.6 Hz,-CH=CH-),7.77(1H,d,J=28.8 Hz,-CH=CH-),7.60-7.55(2H,m,ArH),7.45(1H,dd,J1=2.4 Hz,J2=8.4 Hz,ArH),7.19-7.14(2H,m,ArH),6.87(1H,t,J=7.2 Hz,ArH),6.77(1H,d,J=8.4 Hz,ArH),6.56(1H,d,J=15.0 Hz,-CH=CH-),5.59(1H,d,J=10.8 Hz,-CH=CH-),5.32(1H,d,J=3.0 Hz,-NH-),4.05(4H,q,J=7.2 Hz,CH2),3.84～3.80(12H,m,CH2),3.79～3.76(2H,m,CH2),3.54(1H,d,J=16.8 Hz,CH),3.44(1H,t,J=9.6 Hz,CH),3.33～3.32(1H,m,CH),2.66(2H,t,J=6.6 Hz,CH2),2.62～2.58(4H,m,CH2),1.85(2H,t,J=5.4 Hz,CH2),1.60(6H,s,CH3),1.45(6H,s,CH3),1.15(3H,t,J=7.2 Hz,CH3)。

HRMS (ESI+):C43H53ClN4O8,[M+H]+計算值：789.3630,測定值：789.3611。

1.2.2光譜性能及穩(wěn)定性測定為考察探針溶液在不同pH值下的光學(xué)性能，我們選用HCl(1 mol/L)和NaOH(1 mol/L)溶液調(diào)節(jié)待測探針溶液(5.0×10-6mol/L)的pH值(pH=2～9)，用于紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測試。熒光光譜的測定采用樣品的最大吸收波長作為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm，掃描范圍為795～900 nm。

探針的穩(wěn)定性通過紫外-可見吸收和熒光光譜確定：取20 mL配好的探針溶液(5.0×10-6mol/L)四份，置于254 nm紫外燈下分別照射0、10 、20及30 min后取出，測定其紫外-可見吸收及熒光光譜(測定熒光光譜前，先用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)探針溶液的pH值至4左右)。

1.2.3細(xì)胞毒性及細(xì)胞成像實驗選用人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)作為研究對象，采用標(biāo)準(zhǔn)的 MTT方法測定目標(biāo)探針的細(xì)胞毒性[7,12]。 將處于對數(shù)生長期的 MCF-7細(xì)胞接種于兩塊六孔板中(孔板中放有玻璃片)，每個孔的細(xì)胞數(shù)量在1.0×104～5.0×105之間。培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入含有目標(biāo)探針(1.0×10-5mol/L)的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，作為實驗組。為驗證探針的pH響應(yīng)特性及腫瘤弱酸性微環(huán)境成像的特異性，實驗中選取IR783作為對照組，并將含IR783(1.0×10-5mol/L)的培養(yǎng)基加入另一塊六孔板中加入繼續(xù)培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)液，用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.40)洗滌3次，加入1 mL 4%的多聚甲醛溶液，靜置15 min后棄去孔中液體，并用PBS洗滌。隨后加入DAPI溶液浸泡5 min，PBS溶液洗滌3次后封片(封片前將孔板底部的玻璃片取出，分被置于pH=7.4及pH=6.0的PBS中洗滌一次)。用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞成像效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的設(shè)計

我們設(shè)計合成了一側(cè)吲哚氮原子上無取代基的不對稱菁類化合物(未取代的吲哚氮原子作為pH識別位點)，并在一側(cè)芳環(huán)上引入-NH2來調(diào)控化合物的pKa，同時作為后修飾位點。為增強化合物的親水性并賦予其腫瘤靶向性，我們選用氨基葡萄糖對其進一步修飾，合成了氨基葡萄修飾的pH響應(yīng)型不對稱菁類熒光探針。堿性及中性條件下探針以無熒光的堿式體形式存在；而酸性條件下，氮原子被質(zhì)子化，該化合物由堿式體轉(zhuǎn)變?yōu)樗崾襟w形式，并基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機理產(chǎn)生較強的熒光，進而實現(xiàn)弱酸性微環(huán)境的特異性成像?；衔锏膬煞N存在形式如圖2所示。

圖2 化合物的兩種存在形式Fig.2 Two existing forms of the compound

2.2 光譜性質(zhì)

我們首先考察了介質(zhì)pH值對所合成探針的光譜性能的影響。目標(biāo)化合物在不同pH值下的紫外-可見吸收光譜顯示(圖3(A))，堿性及中性條件下，化合物在520 nm處出現(xiàn)特征吸收峰；隨著溶液酸性的逐漸增強，520 nm處吸收峰的強度逐漸減弱，而780 nm處附近出現(xiàn)了新的吸收峰，且其吸收強度逐漸增加；同時在599 nm處出現(xiàn)等吸收點。熒光光譜顯示(圖3(B))，該探針在堿性及中性環(huán)境中無明顯熒光；當(dāng)體系為弱酸性時，化合物的熒光被激活(最大發(fā)射波長約為810 nm)，且其熒光強度隨體系pH降低而增高，直至pH 接近5.0時其熒光強度達到最大值。更重要的是，將探針溶液由酸性調(diào)節(jié)至堿性時，可發(fā)生上述過程的逆過程。即隨環(huán)境pH值的改變，該探針可實現(xiàn)熒光的“off-on”可逆轉(zhuǎn)變。

圖3 化合物(5.0×10-6 mol/L)在不同pH值下的紫外-可見吸收光譜及熒光光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectra (A) and fluorescence spectra (B) of the compound (5.0×10-6 mol/L) at different pH value

2.3 pKa的測定

圖4 雙波長分光光度法確定化合物的pKa的示意圖Fig.4 Schematic diagram of the dual-wavelength spectrophotometry for the determination of pKa

為進一步探究該探針是否能被腫瘤細(xì)胞弱酸性微環(huán)境特異性激活，實現(xiàn)腫瘤特異性成像，我們采用雙波長分光光度法測定了所合成探針的pKa值[14]。實驗中選取520 nm(堿式體的最大吸收波長)作為第一個工作波長(λ1)，在其酸式體的吸收曲線中選取與520 nm處具有等吸光度的波長(840 nm)作為第二工作波長(λ2)，當(dāng)化合物全部以堿式體存在時對應(yīng)λ1、λ2處的吸光度分別為AP1(0.228)和AP2(0.017)(圖4)。以log{(Ap1-Ap2)/(A1-A2)-1}為縱坐標(biāo)，pH為橫坐標(biāo)作圖，所得直線與x軸的交點即為所求化合物的pKa值。實驗測定化合物的pKa=5.39。該實驗結(jié)論證實所合成探針具有與腫瘤弱酸性微環(huán)境相吻合的pH響應(yīng)范圍。

2.4 穩(wěn)定性考察

作為一種理想的顯影劑，除需具備優(yōu)異的光學(xué)性能外，還需具備良好的光穩(wěn)定性。比較探針溶液和在波長254 nm紫外燈下照射10、20及30 min后的探針溶液的紫外-可見吸收光譜及熒光發(fā)射光譜圖可以看出(圖略)，探針溶液在此過程中未發(fā)生明顯的改變，具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 細(xì)胞毒性及成像性能研究

圖5 不同pH條件下目標(biāo)探針及對照探針的MCF-7細(xì)胞成像Fig.5 MCF-7 cells imaging of the target probe and the control probe under different pH values

上述實驗證實所合成的探針具有pH調(diào)控的“off-on”可逆熒光特性，且其pH響應(yīng)范圍與腫瘤弱酸性微環(huán)境相吻合，有望實現(xiàn)腫瘤特異性成像。因此，我們繼續(xù)開展該探針在細(xì)胞水平的研究。首先將不同濃度的探針(1.0×10-4、5.0×10-5、1.0×10-5、5.0×10-6及1.0×10-6mol/L)與MCF-7細(xì)胞孵育24 h后，考察細(xì)胞的相對存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直到化合物濃度高達1.0×10-5mol/L時，所選細(xì)胞的相對存活率仍高于80%，即此濃度下該探針沒有明顯的細(xì)胞毒性，可用于細(xì)胞成像研究。進而我們繼續(xù)探討了探針的成像特異性。激光共聚焦成像結(jié)果表明(圖5)，經(jīng)目標(biāo)探針孵育后的MCF-7細(xì)胞在模擬的正常體液pH值(pH=7.4)下未呈現(xiàn)出熒光信號，而在模擬的腫瘤弱酸性微環(huán)境(pH=6.0)下呈現(xiàn)出來明顯的熒光信號，且熒光信號均勻的分布在細(xì)胞質(zhì)中。與此相反，與對照探針共培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞在pH=7.4及pH=6.0的條件下呈現(xiàn)出來幾乎相同的熒光信號。以上實驗事實說明目標(biāo)探針能被內(nèi)吞進入細(xì)胞，且能被弱酸性微環(huán)境特異性激活而釋放出較強的熒光。換言之，該探針有效的避免的傳統(tǒng)“always on”型熒光探針在成像時存在的自身背景信號干擾，能實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性成像。

3 結(jié)論

我們設(shè)計合成了pH可逆激活型氨基葡萄糖修飾的不對稱菁類熒光探針。該探針具有良好的生物相容性，且能有效的避免傳統(tǒng)“always on”型熒光探針在成像時所存在的自身熒光干擾及“假陽性”結(jié)果，能實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞弱酸性微環(huán)境的特異性成像。