俱玉云， 陳永雷， 陳興國

(蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州 730000)

Cu(Ⅱ)的重要作用之一是作為很多生理反應(yīng)中酶的輔因子以及威爾森氏病、阿茲海默癥等疾病的診斷標準[1]。然而，Cu(Ⅱ)濃度較高時會導(dǎo)致嬰兒肝損傷及兒童肝硬化等，對人體健康具有危害性[2]。隨著銅在工業(yè)中的廣泛使用，銅含量對人類健康的影響及其測定方法引起了人們越來越多的關(guān)注[3 - 5]。目前，測定Cu(Ⅱ)的方法主要有原子吸收光譜、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜、電化學(xué)等方法[6]。近年來，熒光化學(xué)傳感器由于其高靈敏度、高選擇性、操作簡單等優(yōu)點日益受到人們關(guān)注。然而，大多數(shù)熒光化學(xué)傳感器的熒光強度雖然會隨著Cu(Ⅱ)濃度的變化增強或減弱，但這種單一的以強度變化測定Cu(Ⅱ)的方法通常會受到傳感器濃度(物質(zhì))、檢測器或光源的穩(wěn)定性、復(fù)雜樣品基質(zhì)中共存組分等的干擾或者影響。雙發(fā)射比率熒光方法通過比率熒光來檢測目標物則可避免上述問題的影響[7 - 8]。然而受限于不同種類的熒光類物質(zhì)的尋找及設(shè)計，該類探針的報道相對較少。近年來，碳量子點(CQDs)由于其良好的水溶性、光穩(wěn)定性、生物相容性、低毒性等優(yōu)點備受人們矚目[9 - 11]。雖然CQDs由于具備分子識別作用而被用于化學(xué)傳感器[12 - 18]，但是將CQDs用于比率熒光探針的構(gòu)建，并進一步用于生物樣品檢測方面的研究仍相對較少。與有機熒光類物質(zhì)相比，CQDs用于比率熒光探針的構(gòu)建不需要復(fù)雜的合成過程。Zhou等[8]提出了基于CQDs為熒光輸出信號的雙發(fā)射熒光探針測定Cu(Ⅱ)，但該CQDs對Cu(Ⅱ)沒有識別作用，所以需要修飾一種對Cu(Ⅱ)有識別作用的有機分子，導(dǎo)致制備過程復(fù)雜。

圖1 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs檢測Cu(Ⅱ)的原理Fig.1 Schematic Illustration of the CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs for Sensing of Cu(Ⅱ)

本文通過一鍋法制備了CdS摻雜的CdTe紅光量子點(CdTe/CdS)[19]，通過檸檬酸和聚乙烯亞胺(BPEI)熱裂解制備了藍光CQDs[12]。利用硅酸乙酯水解制備SiO2微球并將CdTe/CdS包裹在該SiO2球內(nèi)[20]，進一步將上述藍光CQDs連接在SiO2球表面，成功制備了雙發(fā)射比率熒光探針(CdTe/CdS@-BPEI-CQDs)，并將其用于檢測人體尿液及血漿中的Cu(Ⅱ)。該探針檢測Cu(Ⅱ)的原理見圖1。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

所制備的樣品形貌及尺寸由Hitachi-6000透射電子顯微鏡(TEM)(日本，日立)進行表征。傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)通過Nicolet Nexus 670傅里葉變換紅外光譜儀來測定。RF-5301PC熒光光譜儀(日本,島津)用于測定體系的熒光光譜，激發(fā)波長為365 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm。

巰基丙酸(MPA)、NaBH4、聚乙烯亞胺(BPEI)購于百靈威試劑公司。CdCl2、Na2TeO3、NaOH、硅酸乙酯、檸檬酸鈉均購自天津光復(fù)精細化工研究所，實驗所用試劑均為分析純。AXLM 1820-V AXL 凈水器用于制備超純水。

1.2 CdTe/CdS紅光量子點的合成

將74 μL的MPA加入至100 mL CdCl2溶液中(0.5 mmol) 并攪拌混勻。將20 mg檸檬酸鈉加入該混合溶液中，攪拌10 min后，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為11.2，加入4.4 mg Na2TeO3及20 mg NaBH4、攪拌至溶解完全并緩慢加熱到90 ℃，冷卻至室溫并用乙醇離心反復(fù)洗滌，將下層固體分散于5 mL乙醇中，備用。

1.3 CdTe/CdS@SiO2的合成

移取2 mL CdTe/CdS量子點溶液分散于100 mL 水和乙醇混合液中(水∶乙醇=1∶4)，超聲至分散均勻。40 ℃下加入4.6 mL濃氨水、460 μL硅酸乙酯，恒溫加熱3 h。冷卻后離心分離，用乙醇和水交替洗滌，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO2，自然晾干后，備用。

1.4 BPEI-CQDs的合成

將0.5 g 聚乙烯亞胺及1.0 g檸檬酸溶解于含有10 mL 超純水的25 mL燒杯中，慢慢加熱至接近200 ℃，恒溫20 min使溶液的顏色變?yōu)榈S色，繼續(xù)加入1 mL超純水，重復(fù)操作10次，溶液顏色變?yōu)殚冱S色時表明形成了BPEI-CQDs。用超純水稀釋至10 mL，0.01 mol/L鹽酸過柱純化。將得到的BPEI-CQDs溶液減壓蒸餾，得到膠狀BPEI-CQDs，于真空干燥箱40 ℃烘干[12]。

1.5 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的合成

將0.12 g CdTe/CdS@SiO2溶解于120 mL乙醇中，加入25.5 mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加熱至 60 ℃，加入225 μL硅酸乙酯及225 μL異腈酸酯，60 ℃恒溫6 h。冷卻后離心，將所得固體用乙醇和超純水交替洗后，自然晾干得到CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs。

1.6 Cu(Ⅱ)的測定方法

依次加入2.47 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)，20 μL 50 mg/mL的探針儲備液(CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs)，10 μL樣品溶液于比色池中混勻。反應(yīng)2 min后，在熒光儀上測定溶液熒光光譜，根據(jù)工作曲線確定Cu(Ⅱ)的含量。

1.7 樣品處理

取健康女志愿者尿液1.0 mL，加入0.1 mL濃HNO3酸化，12 000 r/min離心10 min，取1.0 mL上清液用超純水稀釋至50 mL備用。從冰箱中取出血漿于室溫下解凍，按上述方法酸化、去蛋白后稀釋至一定體積備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs熒光探針的表征

圖2A為CdTe/CdS@SiO2的透射電鏡(TEM)圖，結(jié)果表明大量的CdTe/CdS QDs被成功包覆在SiO2微球內(nèi)。圖2B為CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的TEM圖。圖3A為該熒光探針的X-射線光電子能譜(XPS)圖，圖3B、3C、3D分別為C 1s、N 1s、O 1s的高分辨譜，表明該CQDs被成功修飾在SiO2層表面。

圖2 CdTe/CdS@SiO2(A)和CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(B)的透射電鏡(TEM)圖Fig.2 TEM image of CdTe/CdS@SiO2(A) and CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(B)

圖3 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的X-射線光電子能譜(XPS)(A)圖和C 1s(B)、N 1s(C)和O 1s(D)的高分辨XPS圖Fig.3 XPS of (A) and high resolution XPS,C 1s (B),N 1s (C),and O 1s (D) of the CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs,respectively

在365 nm光激發(fā)下，CdTe/CdS QDs的熒光發(fā)射光譜波長位于656 nm，包覆一層SiO2后其發(fā)射光譜發(fā)生藍移[21]，在653 nm處發(fā)射很強的熒光。利用SiO2微球表面的-OH與BPEI-CQDs表面-NH2的靜電作用，在異腈酸酯存在下發(fā)生脫水作用，成功制備了CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs雙發(fā)射熒光納米探針(圖4)。在365 nm激發(fā)下，該探針的熒光發(fā)射光譜分別位于450 nm、650 nm，表明BPEI-CQDs被成功修飾到SiO2層上。圖5a為BPEI-CQDs的紅外(IR)光譜圖，3 440和1 585 cm-1處的N-H鍵的伸縮振動峰,1 122 cm-1處的C-N鍵的伸縮振動峰為聚乙烯亞胺的特征吸收峰。1 700 cm-1處尖銳的吸收峰對應(yīng)于酰胺鍵(-CONH-)的吸收峰。圖5b為CdTe/CdS@SiO2的IR光譜圖，3 425 cm-1處的峰對應(yīng)于-OH的伸縮振動峰。圖5c 為CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的IR光譜圖，1 700 cm-1處的較弱的尖銳吸收峰對應(yīng)于酰胺鍵的吸收峰，1 585 cm-1處的N-H鍵的伸縮振動峰表明BPEI-CQDs被成功修飾到SiO2微球?qū)由稀?/p>

2.2 檢測機理

雙發(fā)射熒光探針對于Cu(Ⅱ)的響應(yīng)如圖6所示，在365 nm單一激發(fā)波長下，該熒光探針在450 nm、650 nm處的熒光發(fā)射光譜分別對應(yīng)于BPEI-CQDs發(fā)射的藍光，及嵌入在SiO2球內(nèi)的CdTe/CdS QDs發(fā)出的紅光。隨著Cu(Ⅱ)的加入，SiO2層內(nèi)部CdTe/CdS紅光量子點的發(fā)射光強度保持不變，而450 nm處藍光強度出現(xiàn)持續(xù)的猝滅，表明該探針對于Cu(Ⅱ)有較好的響應(yīng)。

2.3 pH影響

考察了不同pH時Cu(Ⅱ)對該雙發(fā)射熒光探針猝猝滅效率的影響(圖7)。結(jié)果表明，當pH在4～6之間時，熒光探針的熒光強度較強(黑色)，當體系pH值過高或過低時，熒光強度均有所降低。圖7中灰色柱狀表明，酸性條件下(pH ≤ 3.0)Cu(Ⅱ)對熒光探針的熒光猝滅作用很小，可能原因為酸性條件下探針表面CQDs的-NH2發(fā)生質(zhì)子化，無法與Cu(Ⅱ)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成銅胺配合物。在堿性條件下(pH >7.0)猝滅效率也較低，可能原因為Cu(Ⅱ)發(fā)生水解抑制了Cu(Ⅱ)與CQDs表面-NH2的絡(luò)合反應(yīng)。當pH在4～7范圍內(nèi)變化時，猝滅效率較高，且當pH在5～7之間變化時，熒光探針具有較好的穩(wěn)定性。綜合考慮pH對探針穩(wěn)定性、熒光猝滅效率的影響，以及該探針用于生物樣品等原因，選擇10 mmol/L PBS(pH=7.4)作為緩沖溶液。

圖4 CdTe/CdS(a)、CdTe/CdS@SiO2(b)和CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)熒光發(fā)射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of CdTe/CdS(a),CdTe/CdS@SiO2(b) and CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)

圖5 BPEI-CQDs(a)、CdTe/CdS@SiO2(b)和CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)的紅外(IR)光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of BPEI-CQDs(a),CdTe/CdS@-SiO2(b) and CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)

圖6 CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs對Cu(Ⅱ)的響應(yīng)Fig.6 Fluorescence emission spectra of CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs upon addition of various concentrations of Cu(Ⅱ)

2.4 穩(wěn)定性考察

在10 mmol/L PBS(pH=7.4)中考察了NaCl濃度對F450/F650的影響(圖8A)。由圖可知，NaCl濃度在1.0×10-7～1.0 mol/L內(nèi)變化時，F(xiàn)450/F650保持不變。實驗還考察了光照時間對F450/F650的影響(圖8B)，表明在120 min內(nèi)F450/F650沒有明顯降低。表明了該雙發(fā)射熒光探針在苛刻條件下的高穩(wěn)定性[22]。

圖8 NaCl 濃度(A)和365 nm光照時間(B)對F450/F650的影響Fig.8 Effects of NaCl concentration(A) and illumination time(B) at λ=365 nm on F450/F650

2.5 選擇性實驗

在Cu(Ⅱ)濃度為60 μmol/L的情況下，考察了金屬離子Hg2+、Cd2+、Mn2+、Fe3+、Ba2+、Al3+、Ca2+、Li+、Mg2+、Na+、K+、Pb2+(10倍)對該探針檢測Cu(Ⅱ)的干擾(圖9A)。結(jié)果表明，與未加入金屬離子的F450/F650相比，加入其它金屬離子后的F450/F650沒有發(fā)生明顯的變化(紅色)。進一步將Cu(Ⅱ)加入到含有其它金屬離子的探針溶液中后，F(xiàn)450/F650明顯降低，表明這些共存的金屬離子對該雙發(fā)射熒光探針檢測Cu(Ⅱ)幾乎沒有影響(綠色)，進一步表明該探針對Cu(Ⅱ)的高選擇性。

在Cu(Ⅱ)濃度為60 μmol/L的情況下，考察了Trp、Glu、Ser、Ala、His、Arg、Lys、Cys、Glucose、GSH(10倍)對該探針檢測Cu(Ⅱ)的干擾。如圖9B所示，加入這些氨基酸后該探針的F450/F650比值發(fā)生很小的變化(紅色)。然而，進一步將Cu(Ⅱ)加入到含有這些氨基酸的探針溶液中，F(xiàn)450/F650發(fā)生了明顯降低，表明氨基酸等物質(zhì)對該雙發(fā)射探針檢測Cu(Ⅱ)幾乎沒有干擾(綠色)。上述結(jié)果表明該體系具有很好的抗干擾能力，能對Cu(Ⅱ)進行選擇性檢測。

圖9 金屬離子(A)和氨基酸(B)對F450/F650的影響Fig.9 Effects of metal ions(A) and amino acids(B) on F450/F650

2.6 方法性能

在最佳條件下對該方法的性能進行了考察，結(jié)果如圖10所示。對Cu(Ⅱ)的響應(yīng)范圍為0～90 μmol/L，當Cu(Ⅱ)加入量大于90 μmol/L時，450 nm處的熒光強度不再發(fā)生變化(圖10A)。實驗結(jié)果還表明，F(xiàn)450/F650與Cu(Ⅱ)的濃度存在良好的線性關(guān)系(圖10B)，線性范圍為0.40～70 μmol/L，其線性回歸方程為：F450/F650=2.150-0.0239c(μmol/L)，R2=0.994，檢測限為0.27 μmol/L，低于美國環(huán)境保護局對飲用水中Cu(Ⅱ)含量的要求(1.3 ppm，約為20 μmol/L)。隨著Cu(Ⅱ)加入量的增加，450 nm、650 nm處發(fā)射光譜強度的變化導(dǎo)致探針溶液在熒光燈下顏色的不斷變化，如圖10C所示。

圖10 Cu(Ⅱ)濃度對探針熒光的影響(A)、工作曲線(B)和相應(yīng)的探針溶液的顏色變化(C)Fig.10 Fluorescence responses of CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs upon addition of various concentrations of Cu(Ⅱ)(from top to bottom,0,0.4,1,5,10,20,40,60,70,80,and 90 μmol/L) in a pH=7.4 PBS solution(A),calibration curve(B) and photographs of the color change of CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs solution(C)

2.7 樣品分析

為了驗證該方法的可行性，將該雙發(fā)射熒光探針分別用于檢測人體尿樣及血漿中Cu(Ⅱ)的含量，通過加標回收的方法對該方法準確度進行了考察，結(jié)果列于表1中?？梢钥闯龌厥章示?03%～105%之間，三次平行實驗的相對標準偏差(RSD)均低于5%。

表1 人尿液及血液中Cu(Ⅱ)的測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

通過將對Cu(Ⅱ)有選擇性識別作用的BPEI-CQDs與被SiO2包裹的紅光量子點CdTe/CdS相結(jié)合，構(gòu)建了一種新型雙發(fā)射比率熒光探針。該探針在單一光源照射下可以發(fā)射出兩種不同的熒光?；贑u(Ⅱ) 與探針表面的BPEI-CQDs的相互作用導(dǎo)致其熒光猝滅的現(xiàn)象，可以選擇性的測定Cu(Ⅱ)。該雙發(fā)射熒光探針已被成功用于人體尿液及血漿中Cu(Ⅱ)的測定。