熊俊逸， 胡 姣， 夏 驪， 龐代文， 張志凌

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1976年，埃博拉病毒首次在蘇丹出現(xiàn)，患者出現(xiàn)出血熱癥狀，引發(fā)腹瀉、嘔吐、胸痛、喉嚨疼、皮疹[1]，致死率高達(dá)90%[2 - 3]。2014～2016年，埃博拉病毒在西非蔓延，據(jù)國(guó)際衛(wèi)生組織報(bào)道，28 646人受到感染，11 323人不治身亡[4]。埃博拉病毒含有7種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是跨膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、RNA聚合酶(L)和4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP)。其中，糖蛋白位于病毒和感染的細(xì)胞表面，參與病毒通過受體介導(dǎo)和膜融合進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程[5]。目前，埃博拉病毒的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[6]、熒光免疫法(FIA)[7]、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)[8]、電化學(xué)傳感法[9]等。ELISA法具有操作簡(jiǎn)單、儀器簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，通過檢測(cè)核蛋白、糖蛋白、IgG、IgM來診斷埃博拉疾病[10]。而比色法，甚至目視比色法，可提供簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)手段[11 - 12]，有利于埃博拉病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

免疫磁球具有便于操控、高比表面積等特點(diǎn)，可從復(fù)雜的基質(zhì)中分離和富集低濃度的目標(biāo)物，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中稀有組分的高靈敏檢測(cè)[13]。因此，本文采用免疫磁球捕獲和富集埃博拉病毒糖蛋白，通過比色信號(hào)對(duì)埃博拉病毒進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TE2000-U 型熒光倒置顯微鏡(日本，Nikon 公司)；UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，Shimadzu 公司)；RF-5301PC 型熒光分光光度計(jì)(日本，Shimadzu 公司)；Synergy 超純水系統(tǒng)(美國(guó)，Millipore 公司)。

Tween 20、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購(gòu)于Sigma Aldrich。MES(C6H13NO4S·H2O)購(gòu)于Aladdin試劑公司。生物素化試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin、1-step Ultra TMB、Dynabeads M-270羧基功能化磁球(2.8 μm，30 mg/mL)，均購(gòu)于Thermo Fisher。脫脂奶粉購(gòu)于Becton Dickinson公司。胎牛血清(FBS)購(gòu)于PAN biotech。脫鹽柱NAP-5購(gòu)于GE healthcare。Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗馬IgG(H+L)(AF 488-IgG，1.4 mg/mL)購(gòu)于Jackson ImmunoResearch。埃博拉病毒糖蛋白(GP，1.8 mg/mL)和馬源抗埃博拉病毒糖蛋白的單克隆抗體(mAb，12 mg/mL)均由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所提供。Femto-TBST(10×)、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP，0.5 mg/mL)均購(gòu)于生工生物工程股份有限公司。NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaOH均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水。

1.2 免疫磁球的制備與表征

1.2.1免疫磁球的制備取100 μL M-270 羧基磁球，用100 μL MES(25 mmol/L,pH=5.0)洗滌兩次；然后將磁球分散到含有25 mg/mL EDC和25 mg/mL NHS的100 μmol/L MES(25 mmol/L,pH=5.0)溶液中，200 r/min 37 ℃搖床孵育30 min后，用100 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.2)洗滌3次，分散到100 μL含有60 μg 抗體mAb的PBS中，搖床孵育4 h。用PBS洗滌3次，分散到100 μL含有1%BSA的PBS中，搖床孵育1 h。最后將磁球用PBS洗滌3次，分散到100 μL中，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫磁球的免疫熒光取1 μL免疫磁球(并以羧基磁球做對(duì)照組)，分散到 200 μL 0.01 mol/L的PBS(pH=7.2)中，加入1 μL AF 488-IgG，搖床孵育1 h。用PBS洗滌5次，得到磁球AF 488-IgG -MB，滴一滴到顯微鏡載玻片上，在熒光倒置顯微鏡的20×和100×物鏡下觀察。

1.2.3免疫磁球表面修飾抗體個(gè)數(shù)的測(cè)定將30 mg/mL羧基磁球分別稀釋125、143、167、200、250、333、500、1 000倍，分別測(cè)定其在600 nm處的吸光度，以磁球濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后測(cè)AF 488-IgG -MB在600 nm處的吸光度，計(jì)算免疫磁球的濃度。

將羧基磁球稀釋到相當(dāng)于AF 488-IgG -MB的濃度，依次加入不同量的AF 488-IgG，用熒光分光光度計(jì)測(cè)其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)：493/519 nm)，以AF 488-IgG的濃度為橫坐標(biāo)，519 nm處的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后測(cè)AF 488-IgG -MB的熒光強(qiáng)度，由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和免疫磁球濃度計(jì)算每個(gè)磁球表面偶聯(lián)的抗體個(gè)數(shù)。

1.3 生物素化抗體的制備

取5 μL抗體mAb(約60 μg)用0.01 mol/L的PBS(pH=7.2)稀釋到100 μL，然后加入15.6 μL 1 mg/mL新配的生物素化試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin，在200 r/min的37 ℃搖床孵育2 h后，用脫鹽柱純化，根據(jù)280 nm處的吸光度，確定生物素化抗體的濃度。

1.4 基于免疫磁球比色檢測(cè)埃博拉病毒糖蛋白的原理及步驟

圖1 埃博拉病毒糖蛋白檢測(cè)原理Fig.1 Schematic illustration of Ebola glycoprotein immunoassay process

基于免疫磁球比色檢測(cè)埃博拉病毒糖蛋白的原理如圖1所示。首先免疫磁球捕獲樣品中的埃博拉糖蛋白，然后與生物素化的抗體形成免疫夾心復(fù)合物，再通過生物素和鏈霉親和素的特異性結(jié)合將辣根過氧化酶標(biāo)記到免疫夾心復(fù)合物上。辣根過氧化物酶催化3，3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)產(chǎn)生顏色變化，通過比色和紫外-可見分光光度計(jì)實(shí)現(xiàn)對(duì)埃博拉病毒糖蛋白的定性和定量檢測(cè)。

取2 μL免疫磁球，加入到100 μL的含有不同濃度埃博拉病毒糖蛋白的溶液中，在200 r/min的37 ℃搖床孵育1 h。用含0.1%的脫脂奶粉和0.05%的Tween 20的PBS(0.01 mol/L，pH=7.2)洗液洗滌3次，再分散到100 μL含有1 μg/mL生物素化抗體的孵育液(含0.3%脫脂奶粉和0.05%Tween 20的0.01 mol/L的PBS)(pH=7.2)中，搖床孵育1 h。用洗液洗滌3次，再分散到100 μL含有10 ng/mL SA-HRP和1%BSA的1×TBST中，搖床孵育1 h。用洗液洗滌5次，然后分散到100 μL TMB溶液中，孵育1 h。使用磁力架吸住磁球，取上清液用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

圖2 (A)和(B)為免疫磁球在熒光顯微鏡20×物鏡下明場(chǎng)和熒光場(chǎng)圖；(C)和(D)為免疫磁球在熒光顯微鏡100×物鏡下的視圖；(E)～(H)為羧基磁球的熒光顯微鏡圖Fig.2 (A) and (B) Bright and fluorescence field images of immunomagnetic microspheres under 20× objective of fluorescence microscope;(C) and (D) images under 100× objective;(E)-(H) images of carboxylic acid functioned magnetic microspheres

2.1 免疫磁球的表征

我們采用免疫熒光方法對(duì)磁球偶聯(lián)抗體進(jìn)行了表征。圖2表明偶聯(lián)抗體后的免疫磁球可以與AF-488標(biāo)記的二抗結(jié)合產(chǎn)生熒光，而對(duì)照組的羧基磁球無熒光，說明抗體成功修飾到免疫磁球上。

為了表征免疫磁球表面偶聯(lián)抗體的個(gè)數(shù)，我們用AF-488標(biāo)記的二抗與免疫磁球表面的抗體結(jié)合，借助AF-488的熒光對(duì)磁球上偶聯(lián)的抗體數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。

磁球在600 nm處吸光度與磁球的濃度有線性關(guān)系(圖3)，測(cè)量AF 488-IgG -MB在600 nm處的吸光度，可以計(jì)算出磁球濃度。由于磁球的散射和吸收會(huì)對(duì)AF-488的熒光產(chǎn)生干擾，在AF 488-IgG -MB等量的磁球溶液中，依次加入不同量的AF 488-IgG，溶液在519 nm處的熒光強(qiáng)度與AF 488-IgG有線性關(guān)系(圖4)，測(cè)量AF 488-IgG -MB的熒光強(qiáng)度可以推算出每個(gè)磁球上的抗體個(gè)數(shù)。經(jīng)過計(jì)算，每個(gè)磁球平均偶聯(lián)有6.6×104個(gè)抗體。

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化及對(duì)照性實(shí)驗(yàn)

我們通過三水平三因素的L9實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化100 μL體系中免疫磁球(IMMS)、生物素化抗體(biotin-Ab)、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP)的用量，分別是0.6 mg/mL、1 μg/mL、10 ng/mL。

為了驗(yàn)證埃博拉病毒糖蛋白檢測(cè)原理的可靠性，我們進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)(圖5)，4組對(duì)照組分別為羧基磁球(磁球未修飾抗體)、空白(未加入待測(cè)物)、缺少生物素化抗體(biotin-Ab)和缺少辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP)。羧基磁球由于表面未封閉產(chǎn)生少量非特異性吸附(A370=0.259±0.052)，其它對(duì)照組均未見明顯的紫外吸收(A370<0.1)，僅有陽性樣品(50 ng/mL埃博拉糖蛋白)在370 nm處有明顯的吸收(A370=2.692±0.241)。

圖3 磁球在600 nm處紫外吸收值與其濃度的線性關(guān)系Fig.3 Absorbance intensity at 600 nm vs. the concentration of magnetic microspheres

圖4 含0.1 mg/mL磁球的0.01 mol/L PBS(pH=7.2)中AF 488-IgG的濃度與熒光強(qiáng)度的線性曲線Fig.4 Calibration curve of the fluorescence intensity of AF 488-IgG at different concentrations in the presence of 0.1 mg/mL microspheres in 0.01 mol/L PBS(pH=7.2,200 μL)

圖5 (A)50 ng/mL埃博拉病毒糖蛋白和對(duì)照組(羧基磁球、空白、缺少生物素化抗體、缺少SA-HRP)檢測(cè)的紫外光譜圖；(B)柱狀圖(插圖：埃博拉病毒糖蛋白檢測(cè)原理)Fig.5 (A) Absorption spectra for the positive (50 ng/mL) and controls (carboxylic acid magnetic beads，blank，absence of biotin-Ab，absence of SA-HRP ) of Ebola glycoprotein detection;(B) Histogram for above detection(Inset:schematic illustration of Ebola glycoprotein detection)

2.3 方法的分析性能

2.3.1線性范圍和檢測(cè)限在優(yōu)化條件下，我們分析了基于免疫磁球的比色檢測(cè)法對(duì)于不同濃度埃博拉病毒糖蛋白的響應(yīng)(圖6)。結(jié)果表明：溶液顏色和370 nm處的吸光度隨著病毒糖蛋白濃度的增加而加深和增大，檢測(cè)信號(hào)與1.0～25.0 ng/mL的病毒糖蛋白呈現(xiàn)線性關(guān)系(R2=0.985)，檢測(cè)限為0.18 ng/mL，并且具有較好的重現(xiàn)性(變異系數(shù)CV=3.3%～15.5%)。

圖6 (A)不同濃度埃博拉病毒糖蛋白顏色變化；(B)紫外光譜圖；(C)370 nm的吸光度與病毒糖蛋白濃度的關(guān)系；(D)工作曲線Fig.6 (A) Photograph of the color change for Ebola glycoprotein at different concentrations and (B) UV absorption spectra(0,1,2.5,5,10,15,25,50 ng/mL);(C) Ebola glycoprotein concentration versus absorbance at 370 nm;(D) Calibration curve of Ebola glycoprotein in the range of 1.0-25.0 ng/mLError bars represent the standard deviation of triple measurements.

2.3.2特異性為了考察該方法的特異性，我們采用H7N9和H9N2禽流感病毒作為對(duì)照樣品進(jìn)行了檢測(cè)。如圖7所示，僅埃博拉糖蛋白有明顯的吸收，而其它病毒均只有很弱的比色信號(hào)，因此該方法具有較好的特異性。

2.3.3復(fù)雜樣品中的檢測(cè)為了考察該檢測(cè)方法的抗干擾能力，我們將埃博拉病毒糖蛋白加入到純牛奶(超市購(gòu)買)和胎牛血清(FBS)中，并進(jìn)行基于免疫磁球的比色檢測(cè)，陽性均表現(xiàn)出強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)，而陰性的檢測(cè)信號(hào)很弱(圖8)，在牛奶和血清中依然具有很高的信噪比。

圖7 埃博拉病毒糖蛋白檢測(cè)的特異性(H7N9和H9N2作為陰性樣品);插圖：紫外吸收光譜圖Fig.7 Histogram for the specificity of this method by using Ebola glycoprotein as positive sample and H7N9，H9N2 as negative samples;Inset:UV absorption spectra for these samples

圖8 不同介質(zhì)中埃博拉病毒糖蛋白陽性和陰性的比色檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Responses of absorption at 370 nm in the presence and absence of Ebola glycoprotein in different media

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了基于免疫磁球的埃博拉病毒糖蛋白的比色檢測(cè)方法。吸光度信號(hào)與埃博拉病毒糖蛋白在1.0～25.0 ng/mL呈良好線性關(guān)系，檢出限達(dá)0.18 ng/mL，方法重現(xiàn)性較好，特異性好，抗干擾能力強(qiáng)。