王 倩, 何小梅, 馮鈺锜

(生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室,武漢大學化學與分子科學學院,湖北武漢 430072)

翻譯后修飾是蛋白質(zhì)在翻譯后通過共價鍵的作用，將某些功能基團通過化學修飾的方式結合到底物蛋白質(zhì)上。蛋白質(zhì)翻譯后修飾是將前體蛋白質(zhì)功能化，進而發(fā)揮正常生物學功能的重要步驟，它幾乎參與了細胞所有的生命活動過程，在生物體內(nèi)具有舉足輕重的作用[1]?？赡娴牡鞍踪|(zhì)磷酸化修飾作為生物體內(nèi)較為重要的翻譯后修飾，參與調(diào)控細胞增殖、分化以及信號傳遞等生命活動。磷酸化的異常是導致細胞癌變的關鍵步驟之一，往往會引起眾多疾病，這使得對磷酸化蛋白質(zhì)的研究具有重要的意義[2 - 3]。

目前，鑒于質(zhì)譜(MS)高靈敏度和高精確度等優(yōu)勢，已成為分析磷酸化蛋白質(zhì)的有力工具[4]。然而，磷酸化多肽在進行MS分析時，離子化效率低、受非磷酸化多肽信號的抑制以及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等基質(zhì)的干擾，導致其檢測靈敏度低。因此，在MS檢測前降低基質(zhì)干擾，對目標多肽的分離富集是十分必要的[5]。磷酸化多肽的預富集方法主要包括固定金屬親和色譜法 (IMAC)[6 - 8]、金屬氧化物親和色譜法(MOAC)[9 - 10]、離子交換色譜法(包括SAX 和 SCX)[11 - 12]、免疫親和富集法和化學衍生法等[13 - 15]。其中，IMAC由于其純化效率高、簡單易行、價格低廉等優(yōu)點而成為磷酸化多肽富集最常用的方法之一。

纖維素作為最豐富的天然聚合物材料，環(huán)境友好、廉價、生物相容性好而且孔隙度高。棉花作為一種纖維素材料，近年來得到極大的關注。并且棉花的表面含有大量的羥基，可用于材料功能化修飾。根據(jù)之前的文獻報道，棉花作為一種纖維材料，能被裝填在注射器針頭或者移液槍吸頭中作為微型化的固相萃取(SPE)裝置，實現(xiàn)對目標分析物快速、簡單的分離富集。在之前的工作中，多種與棉花相關的功能化材料被開發(fā)，并用于復雜生物樣品中目標分析物的選擇性富集，均表現(xiàn)出很好的效果[7]。然而之前的修飾方法可能存在制備方法繁瑣等問題。聚多巴胺(PDA)是貝殼等生物粘性蛋白分泌物的主要成分，具有極強的粘附性，優(yōu)良的親水性和生物相容性。其單體多巴胺(DA)在弱堿性條件下很容易發(fā)生聚合反應，得到PDA，可以附著在幾乎所有材料的表面，并且材料表面所沉積的親水性的PDA膜即使在超聲震蕩的情況下也能保持良好的粘附性[16 - 17]。因此，本文通過在天然的棉花纖維表面修飾PDA，然后利用兒茶酚羥基固定Ti4+，制備了一種IMAC材料Cotton@PDA-Ti4+并將其用于磷酸化多肽的富集。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

多巴胺購自阿拉丁化學試劑(上海)有限公司。Ti(SO4)2、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙醇(EtOH)和氨水(25%)購自上海國藥集團化學試劑有限公司。色譜純乙腈(ACN)購自美國 Fisher Scientific 公司。三氟乙酸(TFA)、H3PO4、 2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)、牛血清白蛋白(BSA)和β-酪蛋白(β-casein)等購自美國Sigma-Aldrich 公司。胰蛋白酶(Trypsin)從美國 Worthington Biochemical 公司購買。純水來自于 Milli-Q 裝置。

棉花(Cotton)及脫脂牛奶購于當?shù)爻?。健康人血清來源于武漢大學校醫(yī)院，放置-8 ℃冰箱中備用。

1.2 Cotton@PDA-Ti4+的制備及表征

PDA的修飾參照文獻方法[18]：稱取200 mg棉花，將其浸入到35 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)中，然后加入DA，使其終濃度為2 mg/mL，將離心管放入搖床，室溫下振蕩10 h。最后得到褐色的PDA修飾的棉花(Cotton@PDA)，用水和乙醇清洗，50 ℃真空干燥，備用。將干燥好的Cotton@PDA放入50 mL的離心管內(nèi)，加入35 mL Ti(SO4)2(100 mmol/L)，將離心管放入搖床，室溫下振蕩2 h。得到Ti4+修飾的棉花(Cotton@PDA-Ti4+)，用水和乙醇清洗，50 ℃真空干燥。

鈦元素的表征采用日本Shimadzu公司的EDX-720型能量色散X-射線光譜儀，其中儀器使用的激發(fā)源為Mg Kα射線。

1.3 實驗方法

1.3.1多肽樣品的制備將β-酪蛋白用溶液I(Tris-HCl，100 mmol/L,pH=8.5)配制成1 mg/mL蛋白溶液，按胰蛋白酶∶β-酪蛋白為1∶50(m/m) 加入胰蛋白酶，于37 ℃水浴鍋中酶解16 h。所得酶解產(chǎn)物旋干后，存放于-8 ℃冰箱。

將1 mg BSA 溶于100 μL變性緩沖溶液(8 mol/L尿素，100 mmol/L Tris-HCl，pH=8.5)。加入TCEP(100 mmol/L，5 μL)，室溫下反應 20 min。然后加入碘乙酰胺(IAA)(100 mmol/L，10 μL)，于室溫避光反應30 min。最后加入300 μL 溶液I，按胰蛋白酶∶β-酪蛋白為 1∶50(m/m) 加入胰蛋白酶， 于37 ℃水浴鍋中酶解16 h。所得酶解產(chǎn)物旋干后，存放于-8 ℃冰箱。

脫脂牛奶酶解物：將100 μL脫脂牛奶用真空離心濃縮儀旋干后，用100 μL變性緩沖液復溶牛奶。加入TCEP(100 mmol/L，5 μL)，室溫下反應 20 min。然后加入IAA(100 mmol/L，10 μL)，于室溫避光反應30 min。最后加入300 μL溶液I，按胰蛋白酶∶β-酪蛋白為 1∶50(m/m) 加入胰蛋白酶， 于37 ℃水浴鍋中酶解16 h。所得酶解產(chǎn)物旋干后，存放于-8 ℃冰箱。

從武漢大學校醫(yī)院收集健康人血樣，通過標準臨床處理步驟制得人血清樣品。將血清樣品保存在-2 ℃冰箱中，在用于富集磷酸化多肽時，血清(2 μL)需要用上樣液稀釋50倍。

1.3.2磷酸化多肽的富集過程稱取5 mg Cotton@PDA-Ti4+，裝填在200 μL移液槍槍頭中，并用一根比較鈍的針頭將 Cotton@PDA-Ti4+固定在吸頭較前端的位置，將長度控制在大約4 mm 左右。將槍頭裝在移液槍上，通過推-吸液體，完成分離富集實驗。

上樣液和解吸液分別為100 μL 0.1%TFA-50%ACN(V/V)和2.5%氨水溶液，加入多肽樣品后通過反復推吸來完成分離富集實驗。上樣前利用移液槍吸/推20次50 μL的0.1%TFA-50%ACN(V/V)實現(xiàn)對材料的活化；活化后吸/推40次上樣液，使磷酸化多肽被充分吸附在材料上。然后用50 μL 0.1%TFA-50%ACN(V/V)清洗兩次，之后用50 μL 2.5%氨水溶液解吸兩次，兩次各推拉30次，然后將解吸液合并，用真空離心濃縮儀旋干。最后用1.2 μL 基質(zhì)溶液(含20 mg/mL 2,5-DHB的50%ACN,1%H3PO4)溶解多肽，全部樣品用于基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析。

對于標準蛋白β-酪蛋白酶解物，上樣量為3 pmol；對于血清樣品上樣量為2 μL；對于脫脂牛奶酶解物，1 mL復溶后，取1 μL上樣。

1.3.2質(zhì)譜分析所有的質(zhì)譜分析都采用日本Shimadzu公司的Axima TOF2型MALDI-TOF2MS儀。MALDI-MS分析時采用波長為337 nm的氮氣激光器，其脈沖寬度為3 ns；采用20 kV的加速電壓，在正離子反射模式下進行檢測。掃描范圍(m/z)1 000～3 500 Da，每張譜圖是200次激光掃描的平均結果。

2 結果與討論

2.1 Cotton@PDA-Ti4+的合成及表征

Cotton@PDA-Ti4+作為一種新的IMAC材料，其制備條件溫和，所需反應時間較短。在堿性條件下，DA單體通過聚合反應在Cotton表面形成PDA膜，得到Cotton@PDA。Ti4+通過與兒茶酚羥基之間的配位作用，被固定到Cotton@PDA上，得到最終產(chǎn)物Cotton@PDA-Ti4+。并且Cotton作為基底，使得反應過程中的分離、清洗等操作步驟變得簡單快速。結果判定(圖1)：經(jīng)PDA修飾后，Cotton由本來的白色變?yōu)楹稚?，說明PDA成功地粘附在Cotton的表面。EDX譜圖(圖2)顯示，Cotton@PDA-Ti4+的主要元素組成為C、N和Ti。其中，Ti元素的質(zhì)量分數(shù)為2.0%。以上數(shù)據(jù)表面，該方法可以有效地將PDA修飾到Cotton表面，并且兒茶酚羥基也可以有效地固定Ti4+。

圖1 棉花在PDA修飾前(a)后(b)的數(shù)碼照片F(xiàn)ig.1 The digital photo of cotton before modification with PDA(a) and after modification with PDA(b)

圖2 Cotton@PDA-Ti4+的能量色散X-射線(EDX)光譜圖Fig.2 EDX spectrum of Cotton@PDA-Ti4+

圖3 β -酪蛋白酶解液直接分析(a)，經(jīng)Cotton@PDA-Ti4+富集后解吸液(b)及萃余液(c)的質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI-MS of tryptic digest of β -casein obtained by direct analysis(a),the elution(b) and eluate(c) after enrichment using Cotton@PDA-Ti4+

2.2 Cotton@PDA-Ti4+富集磷酸化多肽的性能

2.2.1Cotton@PDA-Ti4+富集的選擇性實驗首先將Cotton@PDA-Ti4+用于富集標準蛋白(β-casein)酶解物中的磷酸化多肽。當酶解物直接用MALDI-TOF MS 分析時，質(zhì)荷比m/z1 500附近多為非磷酸化多肽，僅可以看到m/z2 061.8和m/z3 122.1兩個磷酸化多肽的信號，非磷酸化多肽的干擾較為嚴重，并且所能檢測到的磷酸化多肽的峰很弱(圖3(a))。經(jīng)過 Cotton@PDA-Ti4+富集后，我們可以檢測到6個磷酸化多肽的信號峰，其中，所能檢測到的磷酸化多肽的信息如表1所示。質(zhì)荷比為m/z1 500附近的非磷酸化多肽基本消失不見，表明它們并沒有被Cotton@PDA-Ti4+非特異性吸附(圖3(b))。而且在萃余液中，沒有看到磷酸化多肽的信號峰(圖3(c))。以上結果表明Cotton@PDA-Ti4+對磷酸化多肽具有很好的選擇性。

表1 β -casein酶解物富集之后得到的磷酸化多肽信息

a:The phosphorylation sites are marked "-".

為了考察 Cotton@PDA-Ti4+在較多非磷酸化多肽的干擾下對標準磷酸化多肽的富集效果，分別選取了三個比例的多肽混合液作為考察標準。選取的蛋白酶解物分別是β-酪蛋白和BSA，其比例分別為1∶100、1∶500和1∶1 000。多肽混合液直接用MALDI-TOF MS檢測時，譜圖中基本都是非磷酸化多肽的信號峰(圖4(a)、(c)和(e))，表明非磷酸化多肽的存在確實會抑制磷酸化多肽的質(zhì)譜檢測，并且比例越高，抑制作用越強，導致在質(zhì)譜圖中基本看不到磷酸化多肽的信號。因此，進一步證明，在磷酸化多肽進行MS檢測之間，對其進行有效地分離富集是必不可少的。經(jīng)過Cotton@PDA-Ti4+富集后(圖4(b)、(d)和(f))，我們分別可以看到3個質(zhì)譜信號較強的磷酸化多肽峰，與富集前相比，大大降低了非磷酸化多肽信號的干擾。以上實驗結果表明，Cotton@PDA-Ti4+可以非常有效地從高比例非磷酸化多肽的體系中高選擇性地分離磷酸化多肽。

圖4 β -酪蛋白和BSA酶解混合液直接分析(a，c，e)和經(jīng)過Cotton@PDA-Ti4+富集(b，d，f)的質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-MS of the tryptic digest mixtures of β -casein and BSA without(a,c,e) and with(b,d,f) Cotton@PDA-Ti4+ enrichmentMolar ratios of β -casein to BSA are 1∶100(a and b),1∶500(c and d),and 1∶1 000(e and f) after enrichment using Cotton@PDA-Ti4+.

2.2.2Cotton@PDA-Ti4+富集方法效率的考察通過降低β-酪蛋白酶解物用量考察Cotton@PDA-Ti4+的富集效率。隨著β-酪蛋白的用量從100 fmol降低到 10 fmol，我們從圖5(a)和5(b)中分別檢測到3和1個磷酸化多肽的信號。實驗結果表明，Cotton@PDA-Ti4+可用于較低(10 fmol)的樣品中分離磷酸化多肽，說明該方法具有較高的富集效率。

2.3 Cotton@PDA-Ti4+對實際樣品中磷酸化多肽的富集

2.3.1Cotton@PDA-Ti4+富集人血清中磷酸化多肽人體血清作為一種基質(zhì)較為復雜的樣品，不僅含大量蛋白質(zhì)，還有大量的鹽和數(shù)萬個內(nèi)源性多肽。其中，內(nèi)源性磷酸化多肽與人類疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關。然而，復雜的基質(zhì)效應使得樣品在用質(zhì)譜直接分析時，鹽和其他多肽蛋白質(zhì)干擾嚴重，甚至看不到多肽的信號峰。即使通過稀釋，降低基質(zhì)干擾也很難觀察到多肽的信號(圖6(a))，而經(jīng)過材料富集后，可以清晰看到 4 個磷酸化多肽的質(zhì)譜峰(圖6(b)),其序列信息見表2。上述結果表明，Cotton@PDA-Ti4+可以有效地從復雜的生物樣品中成功地分離富集磷酸化多肽。

圖5 不同量β -酪蛋白經(jīng)Cotton@PDA-Ti4+富集后的質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI-MS of tryptic digest of β -casein with different amounts(100 and 10 fmol) obtained after enrichment with Cotton@PDA-Ti4+ 100 fmol(a);10 fmol(b).

圖6 血清樣品直接分析(a)和經(jīng)過Cotton@PDA-Ti4+富集后(b)的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectra of human serum phosphopeptides obtained by direct analysis(a) and after enrichment with Cotton@PDA-Ti4+(b)

表2 人血清富集之后得到的磷酸化多肽信息

"-":The same as table 1.

圖7 脫脂牛奶裂解液直接分析(a)和經(jīng)Cotton@PDA-Ti4+富集后(b)的質(zhì)譜圖Fig.7 MS of tryptic digest of nonfat milk phosphopeptides obtained by direct analysis(a) and after enrichment with Cotton@PDA-Ti4+(b)

2.3.2Cotton@PDA-Ti4+富集脫脂牛奶裂解液中磷酸化多肽脫脂牛奶中除了α-酪蛋白醇和β-酪蛋白醇兩種磷酸化蛋白外，還有大量非磷酸化蛋白質(zhì)。當酶解產(chǎn)物直接經(jīng)質(zhì)譜分析時，雖然可以檢測到 7 個磷酸化多肽的信號峰，但是譜圖中大多數(shù)是非磷酸化多肽的信號峰，并且所能看到的磷酸化多肽的信號很弱(圖7a)。然而經(jīng)過 Cotton@PDA-Ti4+富集后，在解吸液譜圖中可以清楚的看到脫脂牛奶中15個磷酸化多肽的信號峰；并且除這些峰外幾乎沒有其他雜質(zhì)峰的干擾(圖7b)。其中，所能檢測到的磷酸化多肽的信息如表3 所示。以上實驗結果表明 Cotton@PDA-Ti4+可以從復雜的牛奶樣品中高選擇性的分離富集磷酸化多肽。

表3 脫脂牛奶裂解液富集之后得到的磷酸化多肽信息

"-":The same as table 1.

3 結論

本實驗利用PDA修飾棉花來固定金屬離子，合成了一種固定金屬親和色譜材料Cotton@PDA-Ti4+，并將其用于磷酸化多肽的富集。該材料機械性能好，化學性能穩(wěn)定和生物相容性好，且制備過程簡單，通過簡易的In-pipet-tip SPE裝置使整個富集操作過程簡便快速。實驗結果表明，Cotton@PDA-Ti4+不僅可以從簡單的蛋白酶解物(β-酪蛋白酶)中富集到大量磷酸化多肽，并且在含有大量非磷酸化多肽的復雜樣品中對磷酸化多肽也表現(xiàn)出良好的選擇性。另外，利用Cotton@PDA-Ti4+對磷酸化多肽富集的方法也有較高的富集效率。將Cotton@PDA-Ti4+富集方法應用于實際樣品，如人類血清以及脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集，說明該方法有可能用于磷酸化蛋白質(zhì)組的全分析。