李憶，尹全，劉勇

利用多重PCR技術(shù)同時檢測6種棉花轉(zhuǎn)化體的方法研究

李憶1#，尹全2#，劉勇3*

（1.四川民族學院環(huán)境與生命科學系，四川康定626001；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，成都610066；3.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，成都610066）

【目的】建立1種轉(zhuǎn)基因棉花多重聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）檢測方法?！痉椒ā吭囼炦x擇6種轉(zhuǎn)基因棉花作為多重PCR檢測對象，通過引物終濃度配比和引物退火溫度的兩要素全組合優(yōu)化多重 PCR反應體系，并分析方法靈敏度。【結(jié)果】多重 PCR較優(yōu)的 MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531 引物終濃度為 0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20 μmol·L－1， 較優(yōu)引物退火溫度為56℃，方法靈敏度為66個拷貝棉花基因組。利用盲樣對上述體系的驗證結(jié)果顯示，所有盲樣擴增條帶與其含有的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體完全一致。【結(jié)論】本研究建立的體系可用于6種棉花轉(zhuǎn)化體的快速檢測。

棉花；多重PCR；特異性引物；檢測

Abstract:[Objective]The aim of this study was to establish a multiplex polymerase chain reaction(PCR)detection method for transgenic cotton.[Method]Six events in genetically modified cotton were selected for multiplex PCR.Specific primers were designed based on national standards or related literature.The ratio of primer concentration,annealing temperature,and sensitivity of the multiplex PCRreaction system were optimized.[Result]The optimal concentrations for primers MON1445,GHB614,MON15985,MON88913,LLCOTTON25 and MON531 were 0.25,0.30,0.25,0.16,0.30,and 0.20 μmol·L－1,respectively;the optimal annealing temperature of the multiplex PCRwas 56℃;the detection sensitivity of the method was 66 copies of the cotton genome.The verification results of the system showed that the amplified bands of all the known samples were identical to those of the transgenic events.[Conclusion]The system established in thisstudy can be used for therapid detection of six events occurring in genetically modified cotton.

Keywords:cotton;multiplex PCR;specific primer;detection

棉花是較早成功實施商業(yè)化轉(zhuǎn)基因品種種植的植物之一，目前包括我國在內(nèi)的許多國家如印度、美國、阿根廷和南非等均大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因棉花，且發(fā)展非常迅速[1-2]。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應用服務組織（The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）統(tǒng)計，我國2015年轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達370萬hm2，面積有所下降，但其采用率從2014年的93%升高到2015年的96%[3]。目前我國商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因棉花均為自主研發(fā)的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花。除種植外，我國還允許國外抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花531等9種轉(zhuǎn)基因棉花進口用作加工原料[4]。

隨著轉(zhuǎn)基因棉花的廣泛種植以及大量進口轉(zhuǎn)基因棉花用作加工原料，出于對轉(zhuǎn)基因作物安全性的考慮，我國于2002年3月20日起施行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，要求對5類轉(zhuǎn)基因生物所涉及的17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標識，其中包括轉(zhuǎn)基因棉花種子及其產(chǎn)品[5]。因此，建立1套方便、快捷的棉花轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)是貫徹標識制度的重要前提。近年來國內(nèi)外關于轉(zhuǎn)基因植物檢測的報道多涉及轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻及其加工產(chǎn)品[6-8]；而對于轉(zhuǎn)基因棉花的檢測研究報道則相對較少，已有研究報道主要集中在單一聚合酶鏈式反應 （Polymerase chain reaction，PCR）檢測和酶聯(lián)免疫吸附測定 （Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測[9]，且現(xiàn)有檢測技術(shù)存在操作復雜、成本花費高、檢測耗時長以及無法同時檢測多種轉(zhuǎn)化體等缺點。

因此，多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品檢測中應運而生。多重PCR是指在常規(guī)PCR的基礎上，向1個反應體系中加入多對特異性引物，針對1個或多個DNA模板的不同區(qū)域擴增多個目的片段的PCR技術(shù)[10-11]。近年來，多重PCR技術(shù)得到了較大的發(fā)展。尹全等[12]利用多重PCR方法檢測了抗除草劑棉花LLCOTTON25，Germini等[13]建立了1個能同時區(qū)分4種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆的多重PCR體系，陳貞等[14]建立了菜籽粕轉(zhuǎn)基因成分多重PCR檢測體系。多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品檢測中有重要應用價值。

目前，我國國家或行業(yè)標準中轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體的檢測方法均為單一PCR檢測技術(shù)，國內(nèi)少數(shù)學者進行過轉(zhuǎn)基因棉花多重PCR方法研究，但僅局限于多個基因或3～4種轉(zhuǎn)化體的多重PCR檢測[1-2]。為了提高轉(zhuǎn)基因棉花多個轉(zhuǎn)化事件特異性檢測效率，本研究選擇6種進口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化事件作為研究對象，旨在建立1種能快速準確檢測6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體的多重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

轉(zhuǎn)基因棉花 MON1445、GBH614、MON15985、LLCOTTON25、MON531和 MON88913 來源于美國油脂化學家協(xié)會（American Oil Chemists'Society，AOCS）；轉(zhuǎn)基因油菜 GT73來源于美國FLUKA公司；轉(zhuǎn)基因玉米Bt11和Bt176來源于歐盟委員會聯(lián)合研究中心（Joint Research Centre，JRC）標準物質(zhì)與測量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）；轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2來源于美國孟山都公司；轉(zhuǎn)基因油菜RF2、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1為本實驗室保存。植物基因組提取試劑盒購于成都博瑞克生物技術(shù)有限公司；Master Mix購于日本東洋紡績株式會社；毛細管電泳預制凝膠卡夾、分子質(zhì)量標準品（Size marker）購于成都愛奇藝生物技術(shù)公司。

1.2 儀器設備

離心機（5424，德國 Eppendorf公司），PCR 儀（Veritee96-well，美國 ABI公司），DNA 超微量分光光度計（NanoDrop 1000，美國 Thermo 公司），毛細管電泳儀（QIAxcel Advanced，德國Qiagen公司）。

1.3 PCR引物序列

試驗引物序列（表1）參照國家相關標準或相關文獻資料選取，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，并將所有引物濃度稀釋至10 μmol·L－1待用。

1.4 樣品總DNA提取與制備

試驗樣品采用干磨杯粉碎處理，稱取粉碎試驗樣品100 mg用于樣品總DNA的提取，提取步驟參照北京天根生化植物基因組提取試劑盒說明書。樣品總DNA提取后采用超微量紫外分光光度計測定質(zhì)量濃度和純度。然后用1×TAE緩沖液將各樣品總DNA稀釋至25 mg·L－1待用。

1.5 引物特異性驗證

采用標準或文獻中推薦的反應體系和反應條件對引物特異性進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物采用毛細管電泳進行分析，驗證各引物對特異性。

1.6 多重PCR退火溫度及引物濃度兩要素全組合優(yōu)化

多重PCR退火溫度和引物濃度（表2）按照兩要素全組合設計進行優(yōu)化，反應體系為25μL，其中 Master Mix（2×）12.5μL，引物終濃度配比按照表2設置8個濃度梯度，模板2μL，ddH2O補足25μL。反應條件：第一階段94℃預變性3 min；第二階段94℃變性40 s，退火溫度梯度為50、54、56、58、60、64 ℃，退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán)；第三階段72℃延伸3 min，最后4℃保存。對PCR擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳分析，確定引物終濃度和引物退火溫度。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物Table 1 The sequence of primers and the length of amplified productions

1.7 多重PCR靈敏度分析

棉花轉(zhuǎn)化體DNA以TE緩沖液進行梯度稀釋，使得每個反應體系中棉花基因組分別為264、132、66、33、16、8、4、2、1 個拷貝 （1 ng DNA 約合440拷貝棉花基因組），檢測體系設置清水為空白對照進行質(zhì)量控制。

1.8 多重PCR盲樣分析

利用本研究優(yōu)化建立的多重PCR檢測體系對盲樣進行分析，驗證該方法是否可靠，檢測體系設置空白對照（水）進行質(zhì)量控制。

表2 多重PCR引物終濃度方案Table 2 The design of primer concentrations in the multiplex PCR μmol·L－1

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取制備結(jié)果

對提取純化后的樣品總DNA進行測定，所有樣品OD260nm/OD230nm均大于2.0，OD260nm/OD280nm均在 1.8～2.0，質(zhì)量濃度均大于 25 mg·L－1。 以上結(jié)果表明，樣品總DNA質(zhì)量較好，滿足下一步試驗研究需要。

2.2 多重PCR引物特異性驗證結(jié)果

由轉(zhuǎn)化體擴增圖譜（圖1）可見，在含有相關轉(zhuǎn)化體的樣品中6對引物均能在相應目標位置處觀察到特異性條帶，并且未見非特異性條帶擴增，在不含相關基因的樣品中未見特異性條帶和非特異性條帶擴增；空白對照（水）未見條帶擴增，說明檢測體系正常。由此可見，本試驗選擇的引物對可用于多重PCR檢測體系研究。

圖1 轉(zhuǎn)化體擴增圖譜Fig.1 PCR amplification of the events

2.3 多重PCR兩要素全組合優(yōu)化結(jié)果

圖2 引物濃度配比和退火溫度全組合優(yōu)化擴增圖譜Fig.2 The optimized amplification map of primer concentrations and annealing temperature

兩要素全組合優(yōu)化結(jié)果表明：退火溫度太低、引物濃度太高都容易產(chǎn)生非特異性條帶，而退火溫度太高、引物濃度太低又不能獲得理想的目的條帶，只有在相對適宜的退火溫度和引物濃度情況下才能得到理想的結(jié)果。由圖2可見，在較低退火溫度50℃條件下，所有引物濃度梯度都會在200 bp上下各出現(xiàn)1條非特異性條帶擴增，而且有的引物濃度下還會出現(xiàn)引物二聚體，很顯然50℃條件下所有引物濃度均不適宜；而在較高退火溫度區(qū)58℃、60℃、64℃的條件下，每個引物濃度均會有至少1條目的條帶未得到理想擴增，退火溫度越高，得到的目的條帶越少，所以58℃、60℃、64℃的退火溫度條件均不適宜。在退火溫度54℃和56℃條件下，引物濃度梯度為A、B、E、G、H方案時均有 1條目的條帶的擴增不理想，而引物濃度梯度為C、D、F方案時，各目的條帶均被有效擴增?？紤]到各目的條帶擴增效率的一致性，最終選擇D方案作為多重PCR引物濃度配比，選擇56℃作為多重PCR退火溫度。

2.4 多重PCR靈敏度分析結(jié)果

多重PCR靈敏度試驗結(jié)果顯示，在棉花基因組不低于66個拷貝時，6個目標片段均可被有效擴增（圖3）。而當棉花基因組為33個拷貝時，雖然幾個基因都能被擴增，但MON1445和GHB614的目的條帶擴增量太小，條帶模糊，不能準確判斷目的條帶。表明所建立的多重PCR檢測體系靈敏度可達66個拷貝棉花基因組。

圖3 靈敏度擴增圖譜Fig.3 PCR amplification of the sensitivity samples

2.5 多重PCR盲樣分析結(jié)果

采用此多重PCR體系檢測盲樣的結(jié)果表明，所有盲樣擴增條帶與其含有的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體完全一致（圖4）。此結(jié)果進一步驗證了建立的多重PCR檢測方法可靠性較好。

3 討論

Chamberlain等[20]于1988年首次提出的多重PCR方法，已被廣泛應用于基因多態(tài)性分析、定性定量分析、微生物耐藥檢測及動物源性檢測等領域。它是科研、檢測工作的重要手段，具有很高的實用價值，可大大節(jié)約試劑、減少操作時間以及降低檢測成本[21]。李會等[22]對多重PCR法快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米多種轉(zhuǎn)化體技術(shù)優(yōu)勢進行了比較，研究結(jié)果表明與單一PCR檢測技術(shù)相比，成本降低了75%，檢測耗時縮短了63%，檢測產(chǎn)生的廢液減少了75%。

本研究選擇我國進口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因棉花 MON1445、GBH614、MON15985、LLCOTTON25、MON531和MON88913等6種轉(zhuǎn)化體作為檢測對象建立的多重PCR檢測技術(shù)體系，通量較高，有效提高了轉(zhuǎn)基因棉花的檢測效率，為轉(zhuǎn)基因棉花檢測行業(yè)提供了1種檢測方法。

圖4 多重PCR盲樣擴增圖譜Fig.4 Multiplex PCR amplification of the blind samples

多重PCR的優(yōu)化過程中主要需要考慮的因素是引物的選擇。一方面，如果選擇的引物間易產(chǎn)生二聚體，會影響對特異性擴增片段的判斷。本試驗為避免引物產(chǎn)生二聚體，采用Primer 5.0的Multiplex primer功能，對選用引物進行二聚體檢驗；另外，本反應體系選用含有高質(zhì)量重組Taq DNA聚合酶的Master Mix，能提高擴增效率，有效減少引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生。另一方面，如果選擇的引物特異性擴增片段大小太接近，也會影響試驗對特異性擴增片段的判斷。本試驗不同引物特異性擴增片段大小差異最小為21 bp，若采用分辨率相對較低的普通瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果會存在一定困難。因此，本試驗選擇分辨率為3～5 bp的毛細管凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物以滿足試驗要求。

多重PCR的優(yōu)化過程中另一個需要考慮的因素是反應體系中引物的濃度配比和反應程序中的引物退火溫度。多重PCR的優(yōu)化通常根據(jù)擴增條帶質(zhì)量調(diào)整不同引物的濃度，降低過亮條帶的引物濃度，增加條帶過暗的引物濃度，直至最佳擴增結(jié)果[23]。該優(yōu)化方法已應用于轉(zhuǎn)基因橡膠樹[24]、轉(zhuǎn)基因柑橘[25]以及多種致病菌[26]的多重PCR檢測，還可用于其他轉(zhuǎn)基因植物、致病菌等多重PCR檢測，具有一定的通用性。本試驗條件的優(yōu)化采用引物濃度配比和退火溫度全組合方法，共設計8種引物濃度配比和6個引物退火溫度梯度48組反應體系進行全組合優(yōu)化。在兩要素全組合優(yōu)化時非常謹慎，在考慮優(yōu)化條件設置的基礎上，獲得了擴增條帶特異、引物二聚體少、各基因引物擴增效率相對一致的多重PCR檢測體系；通過多重PCR優(yōu)化結(jié)果最終確定了6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體多重PCR檢測體系的退火溫度和引物濃度。由于特異性引物設計對象為6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體，所以本研究結(jié)果僅適用于選用的6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體，并不適用于其他轉(zhuǎn)基因棉花或者轉(zhuǎn)基因植物。

4 結(jié)論

試驗建立了轉(zhuǎn)基因棉花6種轉(zhuǎn)化體特異檢測方法——多重PCR檢測方法，其中檢測體系：東洋紡2×Master Mix 12.5μL，引物 MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531 終 濃 度 為 0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20 μmol·L－1，樣品 DNA 模板 4 μL，補充 ddH2O至25μL；擴增程序：第一階段94℃預變性3 min；第二階段 94℃變性 40 s、56 ℃退火 30 s、72℃延伸30 s，35個循環(huán)；第三階段72℃延伸3 min，最后4℃保存。該方法可實現(xiàn)在1個反應體系中同時檢測轉(zhuǎn)基因棉花6種轉(zhuǎn)化體多個轉(zhuǎn)基因成分，檢測效率高。此體系可用于所選的6種棉花轉(zhuǎn)化體的快速檢測。

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Development of a Multiplex Polymerase Chain Reaction Method for Simultaneous Detection of Six Events in Genetically Modified Cotton

Li Yi1#,Yin Quan2#,Liu Yong3*
(1.Department of Environmental and Life Sciences,Sichuan Minzu College,Kangding,Sichuan 626001,China;2.Analysisand Testing Center,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;3.Instituteof Plant Protection,Sichuan A-cademy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China)

S562.035

A

1002-7807（2017）05-0487-08

10.11963/1002-7807.lyly.20170727

2016-12-29

李憶（1982―），女，碩士，xiangfeng_1981@163.com；#同等貢獻。*通信作者：liuyongdr@163.com

四川省財政現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與示范專項資金（2014CXSF-040）；四川民族學院自辦一般項目（XYB16002）