徐鵬，蔡繼鴻，郭琪，張香桂，徐珍珍，沈新蓮

亞洲棉EST-SNP的挖掘及其在陸地棉中的驗(yàn)證

徐鵬，蔡繼鴻，郭琪，張香桂，徐珍珍，沈新蓮*

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014）

【目的】隨著不同棉種序列數(shù)據(jù)庫(kù)的逐步完善以及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，棉花單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotidepolymorphism，SNP）標(biāo)記開(kāi)發(fā)可利用的公共數(shù)據(jù)資源逐步增加?！痉椒ā勘狙芯炕陉懙孛拮嫦然蚪M的現(xiàn)代種亞洲棉表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequencetag，EST）數(shù)據(jù)庫(kù)，利用CAP3對(duì)亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行拼接。拼接獲得7 187個(gè)重疊群（Contig），再利用QualitySNP軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析?！窘Y(jié)果】在807條含有4條以上EST序列的Contig中查找到2 690個(gè)SNP位點(diǎn)。通過(guò)篩選次要等位基因頻率大于30%的位點(diǎn)，獲得953個(gè)可靠度較高的候選SNP，通過(guò)電子篩選，最終獲得可用于陸地棉分析的SNP 149個(gè)，利用位點(diǎn)特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及酶切擴(kuò)增多態(tài)序列驗(yàn)證了EST-SNP的準(zhǔn)確性?！窘Y(jié)論】本研究證實(shí)基于亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘用于陸地棉研究的EST-SNP切實(shí)可行，并有望將EST-SNP用于陸地棉遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的基因定位以及分子標(biāo)記輔助育種。

亞洲棉；單核苷酸多態(tài)性；酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列；表達(dá)序列標(biāo)簽

Abstract:[Objective]With the development of the cotton genome sequence database and next-generation high-throughput sequencing techniques,the resources available for generating single nucleotide polymorphism (SNP)markers are gradually expanding.[Method]The Gossypium arboreum expressed sequence tags(ESTs)downloaded from the NCBIdatabase were assembled into 7 187 contigs using the CAP3 program.Additionally,the QualitySNPprogram was used for SNPmining.[Result]A total of 2 690 SNPs were obtained from 807 contigs that consisted of more than four ESTs.We obtained 953 highly reliable candidate SNPsby screening for a minor loci frequency of more than 30%.Finally,a total of 149 candidate EST-SNPsthat may be used in G.hirsutum were obtained through in silico screening.An allele-specific polymerase chain reaction and cleaved amplified polymorphic sequencemolecular markerswereused to validatethe accuracy of the selected candidate SNPsin G.hirsutum.[Conclusion]The EST-SNPmarkers from G.arboreum may be used to analyze G.hirsutum.The obtained EST-SNPmarkers will beused to construct genetic maps,map important traits,and completemarker-assisted selection in G.hirsutum.

Keywords:Gossypium arboreum;single nucleotide polymorphism;cleaved amplified polymorphic sequence;expressed sequence tag

目前棉花分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用主要集中于利用公用數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記。由于陸地棉的遺傳基礎(chǔ)狹窄，種內(nèi)遺傳圖譜所含的SSR標(biāo)記數(shù)較少，覆蓋率低，不能滿(mǎn)足實(shí)際育種的需要；所以，開(kāi)發(fā)更多其他類(lèi)型的分子標(biāo)記成為研究者迫切需要解決的問(wèn)題。單核苷酸多態(tài)性 （Single nucleotide polymorphism，SNP）分子標(biāo)記廣泛分布于基因組范圍內(nèi)，具有變異來(lái)源豐富、潛在數(shù)量巨大等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。

較高的前期測(cè)序成本是大規(guī)模開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記的主要限制因素。因此，通過(guò)生物信息學(xué)方法利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)的查找并通過(guò)后期試驗(yàn)加以驗(yàn)證已成為1種快捷高效的SNP開(kāi)發(fā)途徑。隨著不同棉種序列數(shù)據(jù)庫(kù)的逐步完善以及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，棉花SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)的可利用公共數(shù)據(jù)資源逐步增加，使得利用表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）進(jìn)行 SNP 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)具有很多的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前，異源四倍體棉花中存在2個(gè)不同進(jìn)化來(lái)源的亞基因組，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，亞基因組間和亞基因組內(nèi)SNP位點(diǎn)的區(qū)分較困難。通過(guò)序列比對(duì)所發(fā)現(xiàn)的SNP很多是部分同源（異源多倍體內(nèi)亞基因組間的同源性）序列間的差異，而不是等位同源序列間的差異[2]。陸地棉A、D亞基因組種間同源序列的差異使得基于陸地棉EST開(kāi)發(fā)SNP具有較高的假陽(yáng)性，開(kāi)發(fā)效率很低。亞洲棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）被認(rèn)為是異源多倍體祖先基因組的現(xiàn)代種。陸地棉中具有部分同源性的A、D亞基因組分別與亞洲棉、雷蒙德氏棉的基因組具有極小的序列分歧[3]。二倍體與多倍體亞基因組間的相似性、共線性為多倍體陸地棉基因組中區(qū)分SNP提供了材料基礎(chǔ)。

SNP標(biāo)記檢測(cè)方法由于操作復(fù)雜、成本昂貴，需要高端的儀器設(shè)備；因此，SNP標(biāo)記技術(shù)在動(dòng)植物遺傳育種中的應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制。酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列 （Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）是1種將特異引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechain reaction，PCR）與限制性?xún)?nèi)切酶消化結(jié)合的分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，具有共顯性、位點(diǎn)特異性、操作簡(jiǎn)單和成本低等特點(diǎn)，是檢測(cè)SNP位點(diǎn)的常用方法[4]。本研究基于陸地棉祖先基因組的現(xiàn)代種亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)手段大規(guī)模查找SNP位點(diǎn)，通過(guò)電子篩選，獲得可用于陸地棉分析的SNP，對(duì)部分SNP位點(diǎn)在陸地棉中進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR以及對(duì)含有酶切位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)在陸地棉中CAPS驗(yàn)證，以期用于陸地棉遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的基因定位以及分子標(biāo)記輔助育種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

截至2016年6月，61 898條亞洲棉EST序列下載于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 （NCBI）網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），所有 EST 序列以fasta格式保存。

用于SNP驗(yàn)證的陸地棉品種分別為DP555、Miscott7913-83、蘇 12、枝棉 3 號(hào)、徐州 142、魯棉研28。

1.2 EST序列的聚類(lèi)和拼接

為了得到更可靠的SNP位點(diǎn)，首先要對(duì)EST序列進(jìn)行預(yù)處理，從而獲得clean序列用于后續(xù)SNP位點(diǎn)分析。利用Cross_match[5]對(duì)EST序列進(jìn)行載體序列屏蔽，通過(guò) EST_trimmer.pl（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/est_trinimer.pl）腳本進(jìn)行PolyA以及過(guò)短和過(guò)長(zhǎng)EST的處理， 具體參數(shù)為-amb=2，50；-tr5=T，5，50；-tr3=A，5，50；-cut=100 700（參數(shù)含義分別為去掉末端50 bp內(nèi)不明確的堿基，去掉5'的Poly T，去掉3'端Poly A，選擇長(zhǎng)度介于100到700 bp的序列）；CAP3軟件對(duì)EST序列進(jìn)行聚類(lèi)與拼接，拼接最小重疊堿基為100 bp，具體參數(shù)為-p 95-o 100（相似度95%，最小重疊堿基數(shù)100 bp)。

1.3 EST-SNP位點(diǎn)的挖掘

提取在CAP3拼接結(jié)果中4條及以上的EST序列重疊群用于SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)。利用軟件Qual itySNP[6]（http://www.bioinformatics.nl/tools/snpweb/）對(duì)含有4條以上亞洲棉EST序列的重疊群開(kāi)發(fā)SNP位點(diǎn)，同時(shí)分析SNP的類(lèi)型，并對(duì)次要等位基因的頻率進(jìn)行篩選。

1.4 候選SNP位點(diǎn)的驗(yàn)證

根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異PCR引物（http://ausubellab.mgh.harvard.edu/，SNAP program）。 引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)：引物長(zhǎng)度20～36 bp；Tm62～70℃（最適為67℃）；GC含量為45%～65%，最適為 50%。95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min；4 ℃保存。產(chǎn)物在 12 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳，觀察電泳條帶是否具有多態(tài)性。

在候選SNP中隨機(jī)選取具有酶切位點(diǎn)的候選SNP進(jìn)行CAPS驗(yàn)證。首先保證目標(biāo)序列中只存在1個(gè)目標(biāo)酶切位點(diǎn)，然后在目標(biāo)酶切位點(diǎn)兩側(cè)用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)為引物長(zhǎng)度18～22 bp（最適為20 bp），Tm55～65℃（最適為60℃），GC含量為45%～65%（最適為50%）。95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，36 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃永久保存。酶切分析參照TaKaRa的內(nèi)切酶操作指南，用限制性核酸內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，酶切體系包括10 U·μL－1限制酶 0.3μL、1μL buffer、5.7μL ddH2O、3μL PCR 產(chǎn)物，酶切2 h。酶切完畢后酶切產(chǎn)物在12 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳，觀察電泳條帶的多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞洲棉EST的處理及拼接

利用Cross_match和EST_trimmer.pl對(duì)原始EST序列進(jìn)行預(yù)處理后，最終獲得57 308條clean亞洲棉EST序列。利用CAP3對(duì)clean EST拼接，拼接最小重疊堿基為100 bp，序列相似度為95%。亞洲棉EST拼接后獲得7 187條重疊群（Contig），平均每個(gè)重疊群含有4.54條EST，含有2條EST序列的重疊群3 363條，含有3條EST序列的重疊群1 336條，含有4條及以上EST序列的重疊群2 488條，24 688條EST未參與拼接（表 1）。

表1 亞洲棉EST序列拼接結(jié)果Table 1 Assembling results of G.arboreum EST

2.2 EST-SNP位點(diǎn)分析

由于序列的拼接需要大量的冗余序列作為基礎(chǔ)，才能保證候選SNP的可靠度，所以本研究選擇2 488條含有4條以上亞洲棉EST序列的Contig利用QualitySNP軟件查找SNP位點(diǎn) （圖1）。結(jié)果表明，所有用于開(kāi)發(fā)SNP的Contig序列總長(zhǎng)為2 293 541 bp，其中807個(gè)Contig含2 690個(gè)候選SNP，平均每852 bp出現(xiàn) 1個(gè)SNP，每個(gè)Contig含有1～87個(gè)SNP，平均每個(gè)Contig含有3.33個(gè)SNP。隨著Contig所含的EST數(shù)目的增加，SNP數(shù)目也表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢(shì)（圖2）。其中Contig88由132條EST拼接而成，共含有87個(gè)SNP位點(diǎn)。在2 690個(gè)候選SNP位點(diǎn)中，顛換類(lèi)型有1 139個(gè)，轉(zhuǎn)換類(lèi)型1 106個(gè)，單堿基插入缺失類(lèi)型445個(gè)。其中A-G轉(zhuǎn)換類(lèi)型的SNP最多，占22.71%；其次為C-T轉(zhuǎn)換類(lèi)型，占18.40%；C-插入缺失類(lèi)型則最少，僅占2.83%（表2）。為了提高候選SNP的可靠度，進(jìn)一步篩選候選SNP次要等位基因的頻率至少為30%的SNP位點(diǎn)，最終獲得953個(gè)可靠度較高的候選SNP用于后續(xù)的分析。

2.3 可用于陸地棉分析的EST-SNP的電子篩選及其驗(yàn)證

圖1 EST-SNP位點(diǎn)的挖掘Fig.1 Identification of EST-SNP

圖2 不同規(guī)格重疊群平均候選SNP數(shù)量Fig.2 Average amounts of candidate SNP from different contigs

表2 候選SNP的類(lèi)型分析Table 2 Analysis of candidate SNP types

利用以上獲得的807條含候選SNP的Contig作為查詢(xún)序列，以陸地棉EST數(shù)據(jù)庫(kù)（下載于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）作為參考序列進(jìn)行本地 Blastn[7]（E-value＜10－10），獲得與 807 條亞洲棉Contig聯(lián)配的陸地棉EST 40 728條。以QualitySNP分析后產(chǎn)生的allavailsnp文件作為查詢(xún)序列，以上獲得的40 728條與亞洲棉Contig聯(lián)配的陸地棉EST作為參考數(shù)據(jù)庫(kù)，利用短序列比對(duì)軟件 bowtie（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）進(jìn)行比對(duì)，總共681個(gè)SNP能夠比對(duì)到參考數(shù)據(jù)庫(kù)（圖3），其中532個(gè)SNP位點(diǎn)只有1個(gè)基因型能夠匹配，即該類(lèi)型的SNP在陸地棉中表現(xiàn)為單態(tài)性。篩選SNP位點(diǎn)2種基因型均能夠與陸地棉EST完全匹配的序列作為候選，最終獲得149個(gè)可用于陸地棉分析的候選EST-SNP（表 3）。

為了驗(yàn)證候選SNP的可靠性，從149個(gè)候選的EST-SNP中隨機(jī)選擇位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。為了保證獲得合適大小的PCR產(chǎn)物，隨機(jī)選擇SNP位于序列5'端的Contig2325，利用SNAPprogram根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異PCR引物Contig2325-F：5'-AATGGCTTCCATGCTTAGCTCTGGACT-3'，Contig2325-R：5'-CAAAGGCCTCAGGGTCGGCTG-3'。驗(yàn)證結(jié)果表明，在不同的陸地棉品種中Contig2325的候選SNP具有多態(tài)性（圖4）。

圖3 候選SNP在陸地棉EST中的匹配分析Fig.3 Analysis of SNP mapping to EST database of Gossypium hirsutum

表3 149個(gè)可用于陸地棉分析的候選EST-SNP信息Table 3 Information of 149 candidate EST-SNPs

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

隨機(jī)選取具有酶切位點(diǎn)的候選SNP進(jìn)行CAPS驗(yàn)證，用酶切位點(diǎn)識(shí)別序列去搜索149條候選的SNP序列信息。本研究用常用的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列去搜索allavailsnp文件中149個(gè)SNP序列信息 （表 3）， 發(fā)現(xiàn) Contig167、Contig3231在 Eco RⅠ酶切位點(diǎn)處有 SNP。由于Contig3231的酶切位點(diǎn)識(shí)別序列位于序列的5'端，無(wú)法設(shè)計(jì)引物；因此，僅對(duì)Contig167設(shè)計(jì)引物，引物序列為Contig167-F：5'-CATACCTCCC CGATCTTACACC-3'，Contig167-R：5'-ACTAATGCACTGCACTTGACGC-3'。PCR擴(kuò)增酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，Contig167的候選SNP具有多態(tài)性（圖5）。因此，通過(guò)亞洲棉EST開(kāi)發(fā)用于陸地棉分析的EST-SNP基本可行。

圖4 Contig2325候選SNP位點(diǎn)特異性PCR驗(yàn)證Fig.4 Validation of the candidate SNP of the contig2325 using allele-specific PCR

圖5 Contig167候選SNP位點(diǎn)的CAPS驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Validation of the candidate SNP of the contig167 using CAPS

3 討論

利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)知識(shí)及相關(guān)分析軟件進(jìn)行SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)，再制定針對(duì)候選SNP位點(diǎn)的驗(yàn)證方法，因其具有開(kāi)發(fā)成本低快捷高效等優(yōu)點(diǎn)，而被廣大科研工作者青睞。公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)積累了大量的EST序列，很多來(lái)源于不同的個(gè)體或品種，大量的冗余序列拼接時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)不一致的堿基，即為EST-SNP突變位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可以通過(guò)生物信息學(xué)方法檢測(cè)到[8]。近些年來(lái)，在植物方面從模式植物擬南芥[9]，到主要糧食作物水稻[10]、玉米[11]、小麥[12]和大麥[13]，及一些小物種植物，如番茄[14]、松樹(shù)[15]、蘋(píng)果[16]等，該方法均得到了普遍應(yīng)用。EST來(lái)源于功能基因表達(dá)的cDNA片段，相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中增速最快的核苷酸序列是EST序列，使得以EST序列為基礎(chǔ)進(jìn)行相關(guān)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)變得越來(lái)越方便。同時(shí)利用EST序列開(kāi)發(fā)出的候選SNP位點(diǎn)很可能與表達(dá)基因緊密相關(guān)或直接位于基因的編碼區(qū)內(nèi)，可直接應(yīng)用于植物分子育種的研究實(shí)踐。本研究基于陸地棉祖先基因組的現(xiàn)代種亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫(kù)，利用軟件QualitySNP查找到953個(gè)可靠度較高的SNP位點(diǎn)，通過(guò)在陸地棉EST數(shù)據(jù)庫(kù)中電子篩選，最終獲得149個(gè)可用于陸地棉分析的候選EST-SNP，以期用于陸地棉遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的基因定位以及分子標(biāo)記輔助育種的研究。

棉花上SNP標(biāo)記大規(guī)模開(kāi)發(fā)的首次報(bào)道是在2009年Van Deynze等[17]以陸地棉和海島棉為主要研究對(duì)象，開(kāi)發(fā)了約1 000個(gè)海陸棉種之間的SNP。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在棉花SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方面已獲得初步進(jìn)展。Hulse-Kemp等[18]首先對(duì)陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC） 文庫(kù)進(jìn)行末端測(cè)序，然后利用這些末端序列為參考對(duì)12個(gè)陸地棉材料、1個(gè)海島棉及1個(gè)長(zhǎng)萼棉（G.longicalyx Hutchinson&Lee）基因組重測(cè)序并進(jìn)行序列比對(duì)，在12個(gè)陸地棉材料中發(fā)現(xiàn)了132 262個(gè)種內(nèi)SNP標(biāo)記，在陸地棉與海島棉間挖掘到了223 138個(gè)SNP標(biāo)記，在陸地棉與長(zhǎng)萼棉間挖掘了70631個(gè)SNP標(biāo)記。Zhu等[19]通過(guò)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序 （RAD-seq）在22個(gè)陸地棉品種中得到3 090個(gè)SNP標(biāo)記。目前利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)棉花SNP的研究則報(bào)道較少。Li等[20]利用HaploSNPer軟件對(duì)收集到的陸地棉和海島棉的EST進(jìn)行序列比對(duì)，開(kāi)發(fā)出了356個(gè)SNP標(biāo)記。

棉花栽培種主要為異源四倍體，A和D亞基因組間的部分同源序列區(qū)分困難，難以區(qū)別棉花中2個(gè)亞基因組間的單核苷酸變異和亞基因組內(nèi)的單核苷酸變異。這在很大程度上阻礙了棉花中SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用進(jìn)程。此外，棉花測(cè)序工作完成較晚，無(wú)法提供參考基因組，這些對(duì)棉花中SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)進(jìn)程有一定的影響。陸地棉中具有部分同源性的A、D亞基因組分別與亞洲棉、雷蒙德氏棉的基因組具有極小的序列分歧[3]。隨著不同棉種基因組測(cè)序的完成，基于基因組重測(cè)序能夠快速找到大量的基因組變異，因此它是目前發(fā)掘SNP標(biāo)記最強(qiáng)大的工具。Wang等[21]對(duì)陸地棉TM-1和海島棉海7124進(jìn)行了基因組重測(cè)序，以TM-1基因組序列作為參考序列，共在2個(gè)材料間鑒定出6 476 899個(gè)SNP標(biāo)記。

4 結(jié)論

本研究基于陸地棉祖先基因組的現(xiàn)代種亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫(kù)，消除部分同源序列之間的干擾，提高了開(kāi)發(fā)效率，證實(shí)了通過(guò)亞洲棉EST開(kāi)發(fā)用于陸地棉基因組分析的EST-SNP的可行性。

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Development of EST-SNP Markers in Gossypium arboreum and Their Validation in G.hirsutum

Xu Peng,Cai Jihong,Guo Qi,Zhang Xianggui,Xu Zhenzhen,Shen Xinlian*
(Institute of Industrial Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cotton and Rapeseed,Ministry of A-griculture,Nanjing 210014,China)

S562.03

A

1002-7807（2017）05-0401-14

10.11963/1002-7807.xpsxl.20170628

2016-10-17 第一作者簡(jiǎn)介：徐鵬（1981―），男，Semon528@hotmail.com。*通信作者：xlshen68@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（31471545）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20160580）；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)——轉(zhuǎn)基因生物新品種培育（2014ZX08005-004-002）；棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（CB2015A12）；江蘇省協(xié)同創(chuàng)新中心