文/梁思源 呂春爽 安紅艷 李全振 趙寶華

錦鯉皰疹病毒ORF126-ORF27融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析

文/梁思源1呂春爽1安紅艷1李全振2趙寶華1

根據(jù)錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）囊膜蛋白ORF27基因和糖蛋白ORF126基因序列設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，通過PCR成功克隆了錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）ORF27基因和ORF126基因片段，分別將ORF27基因、ORF126基因以及ORF126-ORF27融合基因與原核表達(dá)載體pMAL-c2x連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF126，pMAL-c2x-ORF27，pMAL-c2x-ORF126-ORF27，并轉(zhuǎn)化受體菌BL21（DE3），篩選得到重組菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126），BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF27），BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE分析表明均產(chǎn)生大量目的蛋白；Western blotting分析顯示目的蛋白均具有良好的的免疫原性；表達(dá)的蛋白與佐劑1:1震蕩乳化后免疫小鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測小鼠血清中的抗體效價。結(jié)果表明重組菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）的血清抗體效價明顯高于單蛋白，本試驗(yàn)研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)研制錦鯉皰疹病毒病基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

鯉魚是我國淡水養(yǎng)殖主要品種之一，錦鯉皰疹病毒病可導(dǎo)致發(fā)病鯉魚的大量死亡。錦鯉皰疹病毒病（Koi herpesvirus dasease，KHVD）的病原體為錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV），屬于異皰疹病毒科鯉魚病毒屬，是一種線性、雙鏈DNA病毒，基因組大小約為295kb。1998年從美國和以色列的患病鯉魚中首次分離出錦鯉皰疹病毒，隨后該病毒在世界各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并報導(dǎo)2002年4月在廣東省某錦鯉養(yǎng)殖場進(jìn)口的錦鯉中首次發(fā)現(xiàn)錦鯉皰疹病毒感染，后經(jīng)nested-PCR檢測證實(shí)導(dǎo)致錦鯉死亡的病原體為KHV，該病具有高傳染性和高致病性等特點(diǎn)，春夏秋季節(jié)為該病的高發(fā)期，病情一旦爆發(fā)，難以控制，嚴(yán)重時致死率可達(dá)90%以上，目前還不具備有效的藥物對其進(jìn)行治療，因此，采用免疫接種的方法來預(yù)防該疾病的發(fā)生和傳播具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

研究表明，成熟KHV病毒粒子由40種蛋白質(zhì)組成，包括3個核衣殼蛋白、13個囊膜蛋白、2個間質(zhì)蛋白，及22個未分類的結(jié)構(gòu)蛋白。病毒的囊膜決定病毒分子的抗原性，在病毒侵染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，袁海延等人的研究結(jié)果表明囊膜蛋白ORF27抗原性良好，可用于錦鯉皰疹病毒核酸疫苗的研究，王好等人的研究結(jié)果表明采用重組質(zhì)粒表達(dá)錦鯉皰疹病毒ORF126糖蛋白取得較好的免疫效果。本試驗(yàn)根據(jù)錦鯉皰疹病毒ORF27和ORF126的基因序列設(shè)計特異性擴(kuò)增引物獲得ORF27和ORF126基因，分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，研究囊膜蛋白ORF27、糖蛋白ORF126以及融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性，為探索錦鯉皰疹病毒病的免疫方法開辟一條新道路。

一、材料與方法

1.載體、菌株與實(shí)驗(yàn)動物

患病鯉魚組織由河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測總站提供；表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x由本實(shí)驗(yàn)室（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室）保存；E.coli DH5α感受態(tài)和E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、4周齡的昆明雌性小鼠。

2.主要試劑

Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶、5K DNA Marker、15K DNA Marker、基因組提取試劑盒、TMB單組份顯色液、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、ClonExpress?MultiS一步克隆試劑盒、鼠抗麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽（MBP）、過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG。

3.引物的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI公布的KHV ORF126（ID：11266456），KHV ORF27（ID：11945559）基因序列，利用Primer Premiers 5.0軟件設(shè)計含有酶切位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物（見表1），并在上下游引物5，端引入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（劃線部位），送到生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1.KHV ORF126、ORF27基因特異性引物

4.錦鯉皰疹病毒3型ORF126和ORF27基因片段的PCR擴(kuò)增

根據(jù)表1各基因的特異性引物，以KHV基因組DNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用25ul反應(yīng)體系：ddH2O：18ul；10×buffer（含Mg2+）：2.5ul；dNTPs（2.5mM）：1ul；Primer F（10uM）：1ul；Primer R（10uM）：1ul；模板：1ul；Taq-T DNA聚合酶：0.5ul；

ORF126基因的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘，94℃30s，58.5℃30s，72℃55s，30個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘，4℃保存；ORF27基因的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘，94℃ 30s，60.5℃30s，72℃20s，30個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘，4℃保存；反應(yīng)完成后，將5ul PCR產(chǎn)物與1ul 6×loading buffer混勻后，采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

5.pMAL-c2x-ORF126、pMAL-c2x-ORF27和pMAL-c2x-ORF126-ORF27重組質(zhì)粒構(gòu)建

將PCR成功獲得的ORF126基因與原核表達(dá)載體pMAL-c2x用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF126；同上，使用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hind III構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF27；同上，使用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xba I和Hind III構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF126-ORF27。分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

6.誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)和Western blot 分析

將篩選得到的重組菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126）、BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF27）、BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）和轉(zhuǎn)化含有空質(zhì)粒pMAL-c2x的大腸桿菌BL21（DE3）（pMAL-c2x）分別接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃180rpm過夜培養(yǎng)活化后，按照V（菌種）：V（LB）=1:100的比例接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180rpm擴(kuò)培2h～3h，直至OD600達(dá)到0.4h～0.6h，加入IPTG溶液至終濃度為0.5mmol/L，16℃ 180rpm誘導(dǎo)表達(dá)20h。誘導(dǎo)的菌體超聲破碎后離心獲取可溶性蛋白，SDS-PAGE電泳后，通過轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，孵育鼠抗麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽（MBP）為一抗，孵育過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗，通過顯色液顯色后進(jìn)行分析。

7.重組菌株的小鼠免疫試驗(yàn)

選取4周齡，體重約25g的昆明雌性小鼠，隨機(jī)分為5組，分別為：生理鹽水組、空載對照組、ORF27實(shí)驗(yàn)組、ORF126實(shí)驗(yàn)組和ORF126-ORF27實(shí)驗(yàn)組，每組10只，腹腔注射。組1注射100?L0.9%生理鹽水，組2注射100?L蛋白含量是100?g的空載蛋白，組3注射100?L蛋白含量是100?g的ORF27蛋白疫苗，組4注射100?L蛋白含量是100?g的ORF126蛋白疫苗，組5注射100?L蛋白含量是100?g的ORF126-ORF27蛋白疫苗。共免疫3次，一免使用等體積的弗氏完全佐劑，二免和三免使用等體積的弗氏不完全佐劑，每次間隔7天，斷尾取血，12000rpm4℃離心15分鐘，收集血清，通過間接ELISA實(shí)驗(yàn)檢測其抗體效價。

二、結(jié)果

1.錦鯉皰疹病毒3型ORF126和ORF27基因的PCR擴(kuò)增

以KHV基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，獲得的KHV ORF27和ORF126基因片段與目的基因大小相符（見圖1和圖2）。

3.重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot 分析

將篩選得到的重組菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126）誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，ORF126基因表達(dá)蛋白的理論分子質(zhì)量是29.9kDa，pMAL-c2x載體帶有的麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽大約42.5kDa，因此重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF126表達(dá)蛋白的理論分子量約為72.4kDa，BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126）誘導(dǎo)后在72.4kDa處可見明顯的蛋白條帶，與預(yù)期ORF126蛋白大小一致（見圖9）；經(jīng)Western blot 分析表明，ORF126蛋白特異性良好。

2.重組質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF27、pMAL-c2x-ORF126和pMAL-c2x-ORF126-ORF27鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF27經(jīng)PCR驗(yàn)證、雙酶切鑒定和測序分析，結(jié)果顯示ORF27基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（見圖3和圖4）。

重組菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF27）誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在49.8kDa處可見明顯的條帶，與預(yù)期ORF27蛋白大小一致（見圖10），經(jīng)Western blot 分析表明，ORF27蛋白特異性良好。

重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF126經(jīng)PCR驗(yàn)證、雙酶切鑒定和測序分析，結(jié)果顯示ORF126基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（見圖5和圖6）。

重組菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在79.7kDa處可見明顯的蛋白條帶，與預(yù)期ORF126-ORF27蛋白大小一致（見圖11）；上清液經(jīng)Western blot 分析表明，ORF126-ORF27蛋白特異性良好。

重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-ORF126-ORF27經(jīng)PCR驗(yàn)證、雙酶切鑒定和測序分析，結(jié)果顯示ORF126-ORF27基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（見圖7和圖8）。

4.融合蛋白ORF126-ORF27免疫原性分析

重組蛋白ORF126、ORF27和ORF126-ORF27免疫后的小鼠血清進(jìn)行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，ORF27免疫組血清稀釋度在80000以上，P/N值均大于2.1，抗體效價為1∶80000；ORF126免疫組血清稀釋度在320000以上，P/N值均大于2.1，抗體效價為1∶320000；ORF126-ORF27免疫組血清稀釋度在1280000以上，P/N值均大于2.1，抗體效價為1∶1280000；具體檢測結(jié)果見表2、表3、表4。檢測數(shù)據(jù)顯示，ORF27、ORF126和ORF126-ORF27的免疫原性均較好，融合蛋白ORF126-ORF27免疫組小鼠血清中的抗體效價明顯高于ORF27和ORF126免疫組，且相同稀釋倍數(shù)下，融合蛋白ORF126-ORF27的抗體效價高于ORF27和ORF126蛋白免疫組，說明融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性優(yōu)于單蛋白ORF27和ORF126。

表2.重組蛋白ORF27免疫ELISA結(jié)果

表3.重組蛋白ORF126免疫ELISA結(jié)果

表4.重組蛋白ORF126-ORF27免疫ELISA結(jié)果

三、討論

KHV是一種主要危害鯉魚的急性傳染病病原，KHV的傳染性極強(qiáng)，健康鯉魚一旦接觸到已感染的鯉魚或者水，就會被感染，若發(fā)病可給鯉魚養(yǎng)殖帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前PCR是檢測KHV感染最為精確的檢測方法，其中以主要囊膜蛋白基因?yàn)槟０鍣z測KHV靈敏度更高，有效的藥物和疫苗可以抑制該病的感染，對KHVD進(jìn)行防治的有效方法是免疫，研究表明組織滅活疫苗對該病的免疫效果并不理想，采用減毒疫苗免疫保護(hù)率雖然較高，但是減毒疫苗存在病毒變異的可能性較大，相比之下，開發(fā)有效的基因工程疫苗控制KHV在全球范圍的暴發(fā)顯得尤為重要。目前對KHV相關(guān)基因工程疫苗的制備較少，在已知的眾多KHV功能基因中，只有少部分獲得研究。

已有研究表明ORF27和ORF126免疫原性較高，本實(shí)驗(yàn)以囊膜蛋白ORF27和糖蛋白ORF126為對象，成功克隆得到大小為207bp和822bp的全基因序列，分別構(gòu)建ORF27、ORF126和ORF126-ORF27基因的原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)Western blotting分析顯示目的蛋白均具有良好的的免疫原性，獲得的蛋白作為疫苗免疫昆明小鼠，研究融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性，ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF27、ORF126和ORF126-ORF27蛋白均可以檢測到KHV抗體，免疫原性均較好，其中融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性與單蛋白ORF27和ORF126相比具有很大的優(yōu)勢，因此采用融合基因研制安全高效的防治KHVD感染的基因工程疫苗前景廣闊，本研究結(jié)果對該病的防治及基因工程疫苗的研制具有重要意義。

作者單位：1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2.河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測總站